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相似文献
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1.
应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western—blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDVN蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。  相似文献   

2.
应用RT-PCR技术特异扩增出犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid pro-tein,N)高度保守序列,克隆至质粒pMD18-T中获得重组质粒pMD18-T-N,测序结果证实了重组质粒的可靠性。将目的片段克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经1 mmol/L IPTG诱导,N基因融合蛋白获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析表明,表达产物的相对分子质量与预期的55 000相符。Western-blot检测表明,表达产物与CDV标准阳性血清呈阳性反应。在此基础上,初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原,从而为进一步开发犬瘟热抗体检测试剂盒以及单克隆抗体、胶体金试纸条奠定了基础。  相似文献   

3.
为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%~99.2%和97.9%~99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%~93.6%和96.4%~97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。  相似文献   

4.
将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。  相似文献   

5.
犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析   总被引:8,自引:3,他引:8  
根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCRgA病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达栽体pPROEXX^TM HT,用重组质粒pPROEX^TM HT-N转化感受态E.coli DH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Western blot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBond^TM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1:16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。  相似文献   

6.
根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以CDV感染的Vero细胞总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到549bpDNA片段,将该片段以正确的阅读框架定向克隆于pGEX-4T-1中,然后将重组质粒转化宿主菌Rosetta^TM,在37℃、1.0mmol/LIPTG诱导下外源基因获得良好表达。经SDS.PAGE鉴定,表达的融合蛋白约46ku,与预期值一致。Westernblot试验显示,CDV免疫的小鼠血清可特异的识别该重组蛋白,表明该重组蛋白具有一定的免疫原性。  相似文献   

7.
马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因0RF7,并将其克隆到pMDl8-T载体,构建成重组质粒pMDl8-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAVNC-002532株的同源性为99%。表明0RF7是EAV基因组内的保守序列,将0RF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21(DE3),诱导表达后SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。  相似文献   

8.
为研究犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV) V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献   

9.
为了构建重组犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增CDV F-H融合基因。将F-H融合基因亚克隆至穿梭载体p SIP409多克隆位点上,构建p SIP-F-H表达重组子,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting检测F-H融合蛋白的表达情况。结果表明,成功地扩增了CDV F-H融合基因,构建了p SIP-F-H重组表达质粒,并电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为62.96 ku的F-H融合蛋白,且该蛋白能与CDV阳性抗体反应,具有反应原性。  相似文献   

10.
为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deletingM),将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。  相似文献   

11.
12.
采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。  相似文献   

13.
在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。  相似文献   

14.
为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …  相似文献   

15.
以国际标准强毒R株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离MG,并收集感染鸡所产蛋分离MG。结果表明,人工感染48小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,96小时气囊已被感染,120小时输卵管已能分离到MG,卵巢始终分离不到MG。人工感染鸡自144小时便能在其所产蛋中分离出MG。药物治疗能在72小时内消除感染,油乳剂苗则需24天后逐渐降低蛋内MG分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内MG,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。  相似文献   

16.
本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。  相似文献   

17.
18.
REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.  相似文献   

19.
用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10~0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。  相似文献   

20.
乳酸杆菌益生作用机制的研究进展   总被引:2,自引:0,他引:2  
乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分(表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖)与肠道受体(C型凝集素受体、Toll样受体和 Nod样受体),阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。  相似文献   

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