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试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株)OmpK17基因CDS序列,应用相关软件及程序对OmpK17基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建其原核表达载体pET-OmpK17,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。表达产物纯化后免疫新西兰兔制备多抗血清,应用ELISA和Western blotting分析了重组蛋白的免疫原性。结果显示,肺炎克雷伯菌YZ株外膜蛋白OmpK17基因高度保守,其CDS序列全长513 bp,编码170个氨基酸,与GenBank中其他肺炎克雷伯菌OmpK17基因序列同源性均高于99.6%;OmpK17蛋白分子质量约为18.5 ku,具有较强的亲水性,含有1个信号肽、1个跨膜区和6个抗原决定簇区域,是一种具有桶状三维结构的跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,OmpK17基因在大肠杆菌中获得表达且表达产物主要以包涵体形式存在。ELISA及Western blotting结果表明,肺炎克雷伯菌OmpK17蛋白具有良好的免疫原性。本研究克隆和表达了肺炎克雷伯菌OmpK17基因及其编码蛋白,并证实该蛋白具有良好的免疫原性,为OmpK17基因的生物学特性研究和肺炎克雷伯菌检测方法的建立奠定了基础,为肺炎克雷伯菌基因工程疫苗的研发提供了理论依据。 相似文献
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克隆拟态弧菌(Vibrio mimicus)OmpK(outer membrane protein K)基因并进行相关序列的分析.根据已发表的拟态弧菌OmpK基因序列设计合成引物,以拟态弧菌CGMCC 1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得801bp片段并测序,序列已提交至GenBank(GenBank登录号为FJ462707).拟态弧菌OmpK序列比对结果显示,溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌OmpK基因序列的同源性均大于78%.该基因编码1个含267个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为29.6 ku.利用基因工程方法将该基因片段定向克隆至表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达后的OmpK蛋白分子质量约为28 ku. 相似文献
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克隆拟态弧菌(Vibrio mimicus) OmpK（outer membrane protein K）基因并进行相关序列的分析。根据已发表的拟态弧菌OmpK基因序列设计合成引物,以拟态弧菌CGMCC 1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得801 bp片段并测序,序列已提交至GenBank (GenBank登录号为FJ462707)。拟态弧菌OmpK序列比对结果显示,溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌OmpK基因序列的同源性均大于78%。该基因编码1个含267个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为29.6 ku。利用基因工程方法将该基因片段定向克隆至表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达后的OmpK蛋白分子质量约为28 ku。 相似文献
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为研究猪源性支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的功能及免疫原性,本研究参照GenBank中支气管败血波氏杆菌S798株的外膜蛋白OmpQ基因序列设计引物,通过PCR扩增技术获得OmpQ基因,测序后进行同源性分析,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-OmpQ,转化大肠杆菌Transetta(DE3),经IPTG诱导表达纯化目的蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。结果显示,表达蛋白相对分子质量大小约为36 000,且以包涵体的形式存在。间接ELISA和Western blot结果表明,表达产物具有较好的免疫原性。研究结果为支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的后续生物学功能研究奠定基础,并为支气管败血波氏杆菌的快速诊断提供数据支持。 相似文献
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本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析。根据GenBank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE_0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性。结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42 ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体。 相似文献
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为了解滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD)的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a(+)质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb~(2+)具有较强的抑制作用,而Ca~(2+)对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶160 000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。 相似文献
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为了探究肺炎克雷伯菌外膜磷酸孔蛋白(PhoE)的生物信息学特征和免疫原性,本试验通过在线服务器MultAlin分析不同肺炎克雷伯菌参考株的PhoE氨基酸序列保守性;通过ProtParam和SOMPA分析该蛋白的理化性质和二级结构;通过SWISS-MODEL进行PhoE同源建模;利用IEDB、DNASTAR软件预测该蛋白的优势B细胞抗原表位;通过质粒构建、重组蛋白表达和纯化获得PhoE重组蛋白,免疫接种小鼠后,应用Western blot和ELISA评价其免疫原性。氨基酸序列分析结果显示,PhoE是一种保守性较强的稳定亲水性蛋白质,其主要位于菌体外膜中;PhoE包含的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成占比较大;并且其可形成三聚体的稳定桶形结构。经软件预测和筛选,PhoE具有7个优势性B细胞抗原表位,分别是Y43FSDYDSKDGDQT55、F81SGNKTESDSSQK93、Q172GKNEGREAKKQNGD186、S210DRTNDQ... 相似文献
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根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。 相似文献
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为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae，MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase，GDPD）的生物学功能，本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物，应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因，在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达，纯化表达产物并分析其酶促活性，进而制备其多克隆抗体，应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明，MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp，编码242个氨基酸，重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明，重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚，且其作用的最适pH为9.0，最佳温度为37℃，Pb2+具有较强的抑制作用，而Ca2+对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明，MS GDPD具有良好的免疫原性，可刺激新西兰兔产生高水平的抗体，血清效价高达1：160000；亚细胞定位结果表明，MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布，但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。 相似文献
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试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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试验旨在对单增李斯特菌临床分离株(LM90SB2)的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956bp,ORF全长为1 857bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。 相似文献
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【目的】克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。【结果】试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10... 相似文献
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试验旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶(PDHc-E2)基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因(登录号:CP002058.1)设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体(M.agalactiae)同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体(M.californicum)ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。 相似文献
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根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。 相似文献
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根据GenBank报道的绵羊肺炎支原体(MO)基因序列,设计特异性引物,对MO新疆分离株(MO XJ)溶血素TlyC基因进行克隆及测序;并对该基因及其编码蛋白进行分子特征分析,并与其他支原体相应序列进行同源性分析,构建该基因系统进化树。结果表明,TlyC基因全长为1 239bp,编码426个氨基酸,其中第1~23位氨基酸残基为信号肽,编码区含有跨膜结构域和CBS结构域,二级结构以α-螺旋为主。系统发生分析表明,MO与猪肺炎支原体232株和絮状支原体的相应序列亲缘关系较近,而与其他种支原体的亲缘关系较远。研究首次克隆了MOTlyC基因,为了解MOTlyC生物学功能及其致病中的作用奠定了基础。 相似文献
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为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
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[目的] 克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ 基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法] 以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ 基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ 原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果] NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论] 绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。 相似文献
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对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。 相似文献
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根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物，应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR3.1T载体上，MDPV YZ株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，并对播入片段进行序列测定。测定结果表明，我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%。 相似文献