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传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。 相似文献
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犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。 相似文献
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从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA，采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段，大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序，证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，成功构建了重组表达质粒pGEX-VP1；利用1PTG诱导，表达出了53ku的目的蛋白条带。Western-blotting分析表明，表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。 相似文献
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Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达 总被引：1，自引：1，他引：1
将Asia Ⅰ型口蹄疫病毒YNBS／58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体pET-28a中，转化BL21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白VP1-BoIFN—α-在大肠埃希氏茵BL21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和western-blotting分析，重组的VP1-BoIFN—α蛋白分子质量约为46ku，与预期大小相符。薄层扫描分析显示，重组蛋白VP1-BoIFN—α的表达量占茵体总蛋白的30％，且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用8mol／L尿素溶解后，在变性条件下利用Ni—NTA柱对VP1-BoIFN—α-融合蛋白进行了纯化。 相似文献
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根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。 相似文献
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研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性.将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性.目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应.推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa～158 aa)与C末端(200 aa～213 aa)存在较大差异. 相似文献
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提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。 相似文献
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利用RT-PCR技术。用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株（China/99-2)中扩增得到一级750bp的DNA片段，克隆后，经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较。显示其与国外同源参考序列（O1K/66）的同源性为80.44%。与国内同型参考株（HB/WH/99）的核苷酸序列的同源性达99.06%。随后以重组质粒pGEM-VP1为模板，用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1(650bp)。对目的基因和表达载体pGEX-4T-1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体。转化宿 主菌BL21（DE3）后得到重组质粒pGEX-VP1。经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆。测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析检测。结果表明，结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达，表达产物的分子量约为53ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经薄层扫描分析，表达蛋白约占菌体蛋白总量的20.00%。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达，且表达产物有一定的生物学活性。 相似文献
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将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GM—CSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化RS21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白BoGM—CSF／VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和Western-blotting分析，重组的蛋白质分子质量约为66ku，与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存在；包涵体提取物经变性复性，用透析方法提纯，得到高纯度的表达蛋白。 相似文献
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利用限制性酶切从重组质粒pShuttle-CMV-VP中得到猪O型口蹄疫病毒VP1(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸的基因。将此多抗原表位基因克隆至原核高效表达载体pET43.1 a(+),在E.coliBL21中用IPTG诱导表达了含有猪口蹄疫病毒多抗原表位的融合蛋白,并用镍柱亲和层析法获得了纯化蛋白。W estern-b lot结果表明融合蛋白可被猪O型口蹄疫病毒标准阳性血清所识别,从而为进一步研究FMDV多表位抗原的免疫特性和诊断方法奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中公布的猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)全基因合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因,同时设计了扩增FMDV结构蛋白VP0、VP1和VP3基因的引物。以P1基因为模板,分别经PCR扩增获得FMDV VP0、VP1和VP3基因。扩增产物克隆于Blunt载体中,酶切后将目的片段连接到原核表达载体SUMO中,构建重组表达质粒SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见融合蛋白均获得高效表达,融合蛋白表观分子质量分别约为55、48和40 ku。在IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37 ℃,诱导5 h时融合蛋白表达量最大。Western blotting结果表明,融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。 相似文献
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为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。 相似文献
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口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究 总被引：2，自引：0，他引：2
体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献