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《畜牧与兽医》2015,(12):80-83
采集新鲜东北虎与华南虎的血液,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增β-干扰素(IFN-β)基因,克隆到p MD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,进行菌液PCR鉴定,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,所克隆到的老虎IFN-β基因全长561 bp,编码187个氨基酸,核苷酸序列同源性为99.3%~99.5%。同时将核苷酸序列与其他几种哺乳动物进行遗传进化分析,其同源性在60.8%~98.4%。东北虎和华南虎及其他8种动物的IFN-β基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-β基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高;老虎IFN-β基因的成功克隆,为进一步研究猫科动物IFN-β基因表达、生物学活性和应用奠定基础。 相似文献
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从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。 相似文献
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为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。 相似文献
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根据Genbank中发表鸡α-干扰素基因序列设计一对引物,采用PCR法从SPF鸡的全血白细胞中克隆了α-干扰素基因(ChIFN-α)。序列分析结果显示,与已发表的ChIFN-α的同源性在98.1%以上,与其他禽类的IFN-α同源性在67.4%以上,其中与火鸡IFN-α同源性在89.8%,而与鸭α干扰素同源性仅为67.4%。将该基因连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒,转入BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE分析,可见一条约19ku的清晰蛋白带,结果表明克隆的ChIFN-α基因在原核中获得表达。 相似文献
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从狂犬病病毒CVS毒株致死的小鼠脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得G基因;以pMD18-T-α质粒为模板,PCR扩增得到IFN-α基因.两个基因和pIRES真核表达载体分别双酶切,连接构建P IRES-G/IFN-α,经PCR、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功.测得的G基因序列长1 575 bp,与CVS株G基因氨基酸同源性为98.5%;IFN-α序列长为570 bp,与GenBank中登录号为NM 001017411的IFN-α基因氨基酸同源性为91.6%. 相似文献
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【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3（tripartite motif-containing 3,TRIM3）基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆,菌液PCR鉴定后测序,与不同物种TRIM3基因序列比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测TRIM3基因在大白猪不同组织中的相对表达量。【结果】大白猪TRIM3基因CDS序列全长2 235 bp,编码744个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,大白猪与野猪的相似性最高,达99.7%,与鸭的相似性最低,为75.1%;大白猪TRIM3基因与野猪先聚为一类,与牛和山羊亲缘关系较近。生物信息学分析显示,大白猪TRIM3蛋白分子质量为80.58 ku,理论等电点（pI）为8.32,不稳定系数为40.85,为亲水性蛋白,但不是分泌蛋白,无糖基化位点,预测其有60个磷酸化位点,主要存在于细胞质内;在TRIM3蛋白二级结构中以无规则卷曲为主,占41.67%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。组织表达分析表明,大白猪TRIM3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、气管、结肠中均有分布,肺脏中表达量最多且显著高于其他组织（P＜0.05）。【结论】本研究成功克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,并进行了生物信息学和组织表达分析,为进一步研究大白猪TRIM3蛋白的免疫学功能提供理论依据,对探究大白猪TRIM3基因参与先天性免疫和抗病毒感染分子机制具有重要意义。 相似文献
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根据GenBank中牛干扰素-α(IFN-α)基因序列(A00145),设计并合成了一对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因,并克隆、测序。结果表明,梅花鹿IFN-α基因全长570bp,编码189个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸;序列比较分析发现,梅花鹿IFN-α基因序列与GenBank发表的17种IFN-α基因核苷酸序列同源性为29.6%～93.7%,氨基酸序列同源性为18.4%～91.1%;梅花鹿与其他17种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-α基因存在种属特异性,亲缘关系越近,同源性越高。梅花鹿INF-α基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-α基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌pgsA的基因序列,设计合成了一对能扩增1 225 bp基因片段的引物。以枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,经PCR扩增得到目的片断,然后将其克隆到pMD18-T载体上,经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定。经DNA Star软件将其与Gen-Bank上的pgsA序列进行同源性比较,结果表明,核苷酸同源性均在90%以上,氨基酸同源性为94%以上。核苷酸序列系统进化树分析,发现该试验株与浙江株亲缘关系最近。经ProtScale软件分析表明,该基因所编码蛋白在靠近其N端存在一个跨膜区,为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基础。 相似文献
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将本地沼泽型成年水牛外周血单核细胞(PBMC)在刀豆素A(ConA)的刺激下体外培养,提取培养的单核细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增水牛白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ),并克隆到pMD18-T载体上,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆,然后进行测序。序列分析结果显示:IL-10开放阅读框(ORF)由536个核苷酸组成,共编码178个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IL-10基因的同源性为75.9%～99.6%;氨基酸的同源性为74.2%～100%。IFN-γ的ORF由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IFN-γ基因的同源性为60.7%～99.6%;氨基酸的同源性为40.6%～100%。 相似文献
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为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因的分子特征,试验采用PCR方法从疑似圆环病毒感染的猪组织病料中扩增ORF2基因(702 bp),将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T载体,筛选鉴定重组质粒T-ORF2,并进行序列测定。结果表明:克隆的PCV-2 ORF2与加拿大分离株(AF118097)、美国分离株(AY099495)的同源性最高,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别达98.7%和97.9%,与其他PCV-2毒株同源性分别为97.0%~98.6%和94.0%~97.9%。 相似文献
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试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。 相似文献
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植物血凝素（PHA）诱导培养牦牛外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT—PCR技术扩增牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ基因,分别经PCR、酶切鉴定及测序分析后,再分别构建原核表达重组质粒,用SDS-PAGE和Westernblot分析IPTG诱导表达的重组蛋白。序列分析表明,牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为570bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-A参考序列同源性为94．4％,与黄牛INF-α-B基因（M10953）的同源性最高,为97．0％;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94．2％,与黄牛IFN-δ—1基因（XM-871297）的同源性最高,为96．1％。分子遗传进化树分析表明牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ与黄牛、奶牛和水牛亲缘关系最近,与猪、马、人的次之,与其它动物都较远,说明这两基因均具有种属差异性。诱导表达重组蛋白分析表明,pGEX4T／IFN-α-A和pGEX4T／IFN-α-Ⅱ在大肠杆菌中得到了正确表达,均可表达约44ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,且具有与抗血清发生反应的生物活性。 相似文献
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猪巨细胞病毒(PCMV)四川株gB基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的核苷酸序列(GenBank登录号:FJ870563.1)设计1对引物,采用PCR方法从确诊为猪巨细胞病毒的阳性样品中扩增gB基因,将其克隆到pMD19-T载体上,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒T-PCMV-gB,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上gB相应序列进行同源性分析。结果表明,该基因片段长度为2580 bp,与其他参考株gB基因的核苷酸同源性达98.0%～99.6%;其推导的氨基酸序列与人疱疹病毒6型和7型比较分析结果显示,其同源性分别为42.9%～43.6%和40.5%～40.6%。这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。 相似文献
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鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析 总被引：5，自引：1，他引：5
从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础. 相似文献
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将猪传染性胃肠炎病毒接种ST细胞进行增殖,待细胞出现明显的病变后,将细胞反复冻融3次收获病毒。根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成了1对扩增S基因包含A抗原位点724bp基因片段（Sa）的引物,引物两端分别有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。以感染细胞提取的病毒RNA为模板,经RT-PCR扩增得到目的片段,然后将其克隆到pMD18-T载体上,经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定,构建成功的重组质粒命名为pMD18-T-Sa。用DNAstar软件将其与GenBank上的序列进行同源性比较,结果表明,核苷酸同源性为97%以上,氨基酸同源性为93%以上。根据猪传染性胃肠炎病毒Sa基因核苷酸序列绘制的系统进化树,结果表明,试验株与TH-98株亲缘性最近。 相似文献