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1.
为研究宁夏地区猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行规律,应用RT-PCR的方法从PRRSV分离株GP3蛋白中扩增出ORF3基因cDNA片段。结果显示,ORF3基因全长765 bp,编码254个氨基酸,与北美型毒株VR-2332的同源性达到85%以上,与欧洲型毒株LV的同源性低于60%,与国内近3年主要流行毒株JXA1、HEB1、HUB2亲缘性较近。对PRRSV分离株的亲水性分析表明,GP3蛋白的前57位氨基酸为疏水性信号肽序列;对PRRSV分离株GP3蛋白抗原表位分析表明,与国内外其他毒株抗原表位预测的结果基本一致,说明PRRSV分离株GP3蛋白具有与其他毒株相近的抗原特性。 相似文献
2.
根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株核苷酸序列,设计了扩增PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因的1对引物,利用RT-PCR方法,从PRRSV JL/07/SW毒株的细胞培养物中成功的扩增出GP5基因,其中GP5基因全长603 bp,与国际PRRSV美洲型VR-2332毒株的GP5基因序列同源率为89.2%;随后,将该基因与原核表达载体pGEX-4T-1连接,转化到宿主菌BL21中进行表达.结果证实PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因成功地进行了原核表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白含量的22.8%. 相似文献
3.
根据PRRSV VR-2332毒株核苷酸序列,设计针对GP5基因的特异引物,以PRRSVJL/07/SW毒株细胞培养物为模板,利用RT-PCR方法,成功的扩增出GP5基因,将该基因与真核表达载体pCI-neo连接,转染Marc-145细胞中,用间接免疫荧光试验、SDS-PAGE和western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果:RT-PCR分别扩增出GP5基因大小与预期一致,与国际PRRSV美洲型VR-2332毒株的GP5基因序列同源率为89.2%;间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot试验证明GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;同时利用pCI-neo真核表达载体在Marc-145细胞中成功表达了PRRSVJL/07/SW毒株GP5基因,为下一步研究蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
4.
《中国动物传染病学报》2015,(6)
研究表明,动脉炎病毒GP2、GP3和GP4形成的复合物决定病毒的细胞嗜性,猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP2和GP4能与细胞受体CD163进行相互作用。GP3和GP4也是刺激猪体产生中和抗体的病毒蛋白。本研究选用本实验室在2013~2014年分离到的11株PRRSV毒株进行ORF2、ORF3和ORF4基因的克隆和序列测定,并与国内外代表毒株进行比对分析。结果显示,11株PRRSV GP2、GP3、GP4核苷酸序列同源性分别为94.6%~99.6%、95.3%~100%、93.9%~100%;与美洲经典毒株VR-2332 GP2、GP3、GP4氨基酸同源性分别为91.4%~93.0%、85.1%~86.7%、89.4%~91.1%;与HP-PRRSV毒株对应氨基酸的同源性分别为96.1%~99.6%、95.3%~98.8%、95.0%~99.4%。序列比对表明:11株PRRSV GP2、GP3、GP4蛋白氨基酸序列未出现缺失和插入,但出现多处点变异。遗传进化分析表明:11株PRRSV均分布在美洲型分支上,且与HP-PRRSV亲缘关系较近。 相似文献
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PRRSV缺失变异毒株JL/07/SW株的分离鉴定及序列分析 总被引：4，自引：3，他引：1
分离并鉴定了1株猪繁殖与呼吸综合征病毒,经病毒生物学特性测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确定为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒,将其命名为JL/07/SW株.根据猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株及变异毒株的核苷酸序列,设计合成了针对NSP2变异序列、N基因以及GP5基因的引物,扩增出正确的序列,经测定的序列比对后,发现该毒株为美洲型变异毒株,NSP2上缺失了30个氨基酸,而GP5和M基因相对保守. 相似文献
6.
从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究 总被引：39，自引：0，他引：39
采用猪肺巨噬细胞和Marc-145细胞培养对国内暴发流行PRRS的某地猪场进行了病毒分离,从流产胎儿分离出特征性致细胞病变因子。用PRRSV SDOW-17单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,证明从4头流产胎儿分离出4株PRRSV(CH-la,CH-lb,CH-lc,CH-ld)。这4株毒均可在猪肺巨噬细胞和Marc-145细胞上生长,并产生特征性CPE变化。用PRRSV美国分离毒株VR-2332和NVSL抗血清分别对4株CH-1、VR-2332和NVSL毒株感染细胞进行间接免疫荧光试验,结果表明4个CH-l毒株近似于美洲型PRRSV。间接免疫荧光试验证明,4个CH-l分离株与HCV、PrV、PPV、TGEV、PEDV和HEV无交叉抗原。本文首次报道在国内暴发生殖和呼吸道综合征猪群分离到PRRS病毒。 相似文献
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为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较。结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332) 的核苷酸序列同源性分别为88.8%、99.5%、88.7%、88.7%和83.5%。系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型。以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据, 同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
8.
《中国兽医杂志》2015,(10)
为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,收集了福建省不同地区的12株PRRSV,并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS,10株为美洲型PRRSV,与VR-2332、JXA1等美洲型参考毒株的氨基酸的同源性为89.5%~100%,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为59.5%~63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分离株为欧洲型PRRSV,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为91.4%、92.2%,而与VR-2332、CH-1a等美洲参考毒株的氨基酸的同源性为60.3%~64.5%。美洲型PRRSV ORF7编码N蛋白氨基酸虽然发生了变异,但相对保守。 相似文献
9.
针对PRRSV ORF5基因组设计了1对特异性引物,利用RT-PCR的方法,对在南方地区分离的4株PRRSV ORF5基因进行了基因扩增,克隆到pMD18-T载体后测序,获得了4株PRRSV ORF5基因全长603bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对4株PRRSV ORF5基因序列进行了遗传进化分析,结果显示GD1、GD2、GD3、GD4株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为87.1%、87.2%、87.1%和86.9%。利用系统进化树分析表明GD1、GD2、GD3、GD4株均属于美洲型。进一步采用序列分析软件对病毒结构蛋白推导糖基化位点比较,结果表明不同毒株GP5糖基化位点在基序和位置上均有所不同,这可能与毒株的毒力、免疫原性的差异相关,这些为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备 总被引：5，自引：1，他引：5
将猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1．载体上，并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现，融合表达的rtGP5蛋白约42ku，将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析，证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5，按50pg／只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，经腹腔免疫BALB／c小鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原，通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测，筛选阳性克隆，结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现，获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型，且轻链均为k链。 相似文献
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The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) GP4 and GP5 proteins are two membrane-associated viral glycoproteins that have been shown to induce neutralizing antibodies. In the present study, the host cell gene expression profiles altered by the GP4 and GP5 proteins were investigated by the use of DNA microarrays. Sublines of Marc-145 and HeLa cells were established by stable transfection with open reading frame (ORF)4 and ORF5 of PRRSV, respectively, and differential gene expressions were studied using microarray chips embedded with 1718 human-expressed sequence tags. The genes for protein degradation, protein synthesis and transport, and various other biochemical pathways were identified. No genes involved in the apoptosis pathway appeared to be regulated in GP5-expressing cells. The microarray data may provide insights into the specific cellular responses to the GP4 and GP5 proteins during PRRSV infection. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区. 相似文献
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为进一步研究PRRSV GP5蛋白的生物学功能,本研究将已分离的PRRSV北美洲型野毒株TA-12的GP5基因分为4段(79 bp～207bp、133bp～330bp、229bp～492bp和382bp～603bp)分别克隆于pGEX-6p-1中,并转化E.coli BL21(Rosetta)细胞进行诱导表达.表达蛋白经纯化后,以间接荧光方法(IFA)检测它们与Marc-145细胞的相互作用.IFA检测结果表明GST-GP5-1和GST-GP5-2融合蛋白均能够与Marc-145细胞结合,而且其结合位点在27aa～110aa区域.本实验为进一步研究GP5蛋白生物学功能提供试验依据. 相似文献
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PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础. 相似文献