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PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化 总被引：31，自引：0，他引：31
为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5，通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5)。将d ORF5克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dORF5，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为20．8％。Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。 相似文献
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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株序列设计1对引物,应用PCR方法从重组质粒PMD-ORF5扩增得到缺失信号肽序列的基因片段dORF5,将dORF5克隆至原核表达载体PBAD/Myc-His B上,成功地构建了重组表达质粒PBAD/Myc-His B-dORF5,转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞,经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为19.4 ku的目的蛋白,经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达17.1%。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,这为进一步研究GP5蛋白的结构、功能和开发新型诊断试剂盒、新型疫苗提供了理论与物质基础。 相似文献
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通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础 相似文献
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用RT—PCR方法从河南分离的1株（HN6）猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5（deleting ORF5），并将其克隆到pMD18-T载体中测序，再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用不同浓度IPTG分别于37℃诱导，经SDS—PAGE分析，所表达的融合蛋白的分子质量约31．4ku，薄层扫描分析显示，表达量占菌体总蛋白含量的28．8％。Western—blotting结果表明，重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实，该蛋白可用于PRRSV的诊断。 相似文献
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旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。 相似文献
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利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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魏静 《四川畜牧兽医学院学报》2009,(4):28-32
在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。 相似文献
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以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。 相似文献
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本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。 相似文献
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REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air. 相似文献
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