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《动物医学进展》2020,(4)
为获取双峰驼免疫球蛋白M(IgM)重链恒定区的表达产物及抗体,首先在GenBank找出收录的双峰驼IgM、IgA、IgE、IgG重链恒定区基因序列,比对IgM与IgA、IgE和IgG的氨基酸序列,选取一段差异较大的蛋白序列片段,转换成相对应的基因片段,PCR扩增选取的基因片段,插入pET-28a(+)载体构建重组载体,转化进大肠埃希菌BL21,并诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白,后利用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗血清,ELISA和Western blot鉴定获得的血清。结果显示,成功构建了载体pET-28a-IgM,诱导表达的目的蛋白分子质量为18.7 ku,与预期相符。ELISA方法检测抗血清效价为1∶32 000,Western blot结果显示该血清能特异性识别原核表达蛋白,说明双峰驼IgM兔抗血清的成功制备。 相似文献
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鹅卵黄IgG的纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 总被引：4，自引：0，他引：4
采用三氯甲烷去脂、无水Na2S04盐析、DEAE23纤维素层析相结合的方法纯化鹅卵黄IgG,SDS-PAGE检测表明,所得鹅卵黄IgG纯度可达93%;用纯化的IgG免疫家兔,抗血清经双向琼脂扩散,证明兔抗鹅IgG抗血清效价约1:64,免疫电泳试验检测,证明得到了特异性抗血清,提取兔抗血清的IgG,用辣根过氧化物酶标记,制备了兔抗鹅IgG的酶标抗体,酶标抗体的效价为1:6400. 相似文献
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为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1∶32 000,Western blot鉴定抗体能特异性识别原核表达的pET-28a-IgA-H蛋白,并能有效地将双峰驼IgA与IgG区别开来,表明成功获得了双峰驼IgA重链恒定区的重组蛋白及特异性良好的多克隆抗体。 相似文献
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构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因库,并分析其库容量及多样性。结果表明,经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与莱克多巴胺人工抗原特异性结合的噬菌体展示纳米抗体。构建的骆驼天然重链单域抗体库的库容量为107,多样性良好,独立克隆所占比例为90%,筛选出针对莱克多巴胺人工抗原的噬菌体颗粒。已成功构建骆驼天然噬菌体重链抗体库,并筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和莱克多巴胺的免疫学检测奠定基础,并为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。 相似文献
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本试验采用辛酸去脂、饱和硫酸铵溶液盐析法提纯鹅卵黄抗体IgY,采用SDS-PAGE方法分析其纯度;用纯化后的IgY免疫试验兔,收集血清,测定血清抗体效价;采用辛酸-硫酸铵法结合Protein G树脂亲和层析法纯化免血清IgG,用改良的高碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记,直接ELISA法测定标记物效价.结果表明,提纯的鹅卵黄IgY浓度为11.5 mg/mL,纯度约为92％;血清琼脂扩散抗体效价为1∶32;Western Blotting试验证明,兔血清中含有抗鹅卵黄抗体IgY重链及轻链的特异性抗体;直接ELISA法测得标记物效价为1:1 100. 相似文献
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经硫酸铵盐析、柱色谱分离得到纯化的鸡血清IgG。继用2-巯基乙醇还原、碘乙酰胶烷化拆开IgG的轻、重链,再经Sephadex G100凝胶过滤柱色谱分离得到IgG轻链。以IgG轻链免疫家兔制得兔抗鸡IgG轻链抗血清。 相似文献
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分别用碳二亚胺(EDC)法和生理学法将半抗原青霉素G与BSA、OVA偶联,合成4种抗原分别为PEN-EDC-BSA、PEN-BSA、PEN-EDC-OVA和PEN-OVA。用PEN-EDC-BSA与PEN-BSA分别免疫兔获抗青霉素G多克隆抗体,间接ELISA法检测结果表明使用生理学偶联方法合成的结合抗原其免疫原性好于EDC法。免疫PEN-BSA组的兔抗血清效价达到1∶204800。用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗血清,IgG的最高浓度为27.42mg/mL。 相似文献
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【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1 024 000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×1012CFU的纳米抗体文库,文库阳... 相似文献
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为了分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并制备该蛋白的多克隆抗体,试验用rProtein A FF亲和层析和Superdex200 Increase 10/300GL分子筛的方法分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并通过SDS-PAGE对纯化蛋白的部分特性进行分析;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果表明:从鲤鱼血清中分离纯化出鲤鱼IgM蛋白,纯化后纯度可达99.53%;重链和轻链的分子质量分别为81.3 ku、26.4 ku;兔抗鲤鱼多抗效价高达1∶640 000以上。说明试验所采用的rProtein A FF亲和层析法可提取到高纯度的鲤鱼IgM,适合在实验室纯化鱼类IgM。 相似文献
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M J Lawman S Joiner D R Gauntlett M D Boyle 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》1985,8(1):1-8
The reactivity of bovine IgG with protein A is confusing with respect to which of the bovine IgG class and subclasses are reactive. We have, therefore, re-examined the interaction of bovine immunoglobulins with protein A. The results presented in this paper indicated that at pH 8.0 protein A binds only immunoglobulin of the IgG2 subclass. The bound IgG2 can be readily recovered from an immobilized protein A column at pH 5.0. Furthermore, the antigenic IgG2 eluted demonstrated two charged species which could readily be separated by ion-exchange chromatography. These results indicate that IgG2 in the bovine exists in two sub-subclasses, IgG2a and IgG2b. The two sub-subclasses of IgG2 could be rapidly isolated with a good yield in two-steps namely protein A affinity chromatography followed by ion exchange chromatography. 相似文献
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采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。 相似文献
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兔抗鸡传染性法氏囊病抗体的制备和纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用自然发病的传染性法氏囊病（IBD）病鸡的法氏囊组织制作鸡IBD油佐剂灭活苗,用鸡IBD油佐剂灭活苗多点皮下注射健康成年兔,获得高免兔抗鸡IBDV血清,经过盐析、透析的方法制备高纯度的兔抗鸡IBDV高免IgG。兔血清中抗体效价为1∶128,蛋白质含量为40.3~48.8 mg/ml;纯化后效价为1∶32,蛋白质含量为18.0~23.0 mg/ml。用此试剂对安徽部分地区疑似鸡IBD的病例进行了诊断,取得良好效果。该试剂为临床琼脂扩散试验(AGP)检测IBDV抗原提供高效价的抗体,并为临床免疫组化法检测IBDV提供可靠的抗体。 相似文献
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为获得新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1 095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 μg/mL、0.5 μg/mL和1∶256 000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6 400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409 600和1∶102 400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。 相似文献
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为了研究抑制素α（INHα）主动和被动免疫对哈萨克羊生殖激素含量的影响，本试验在对抑制素α重组质粒表达菌株进行诱导表达的基础上，将经纯化、鉴定的抑制素α重组蛋白免疫接种新疆双峰骆驼，制备驼抗抑制素α多克隆抗体，并对其进行纯化，检测抗体效价，验证抗体的特异性。之后选择3~5岁、发情时间相近并处于间情期的45只成年哈萨克羊随机分为3组，分别作为抑制素α多克隆抗体免疫组（A组）、抑制素α重组蛋白免疫组（B组）及对照组（C组），每隔10 d连续进行3次加强免疫，应用ELISA法检测在绵羊繁殖活动中具有重要功能的5种生殖激素：促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕酮素（P4）、雌激素（E2）、抑制素（INH），并检测血液生化指标。结果显示，IPTG的最佳诱导浓度是0.6 mmol/L，在4 h时诱导出产量较高的抑制素α包涵体蛋白，纯化后的抑制素α重组蛋白纯度较高，并具有较好的免疫原性，经进一步验证发现，制备的抑制素α抗体效价为1：512 000，该抗体可与抑制素α重组蛋白特异性结合。说明成功制备了具有免疫原性的抑制素α重组蛋白和高效价的驼抗抑制素α多克隆抗体。免疫后A组LH、P4含量和B组FSH、LH、P4、E2、INH含量与C组相比差异不显著（P>0.05），而A组FSH含量和E2含量显著高于C组（P<0.05），INH含量显著低于C组（P<0.05）。通过血液生化指标检测发现，抑制素α蛋白和抑制素α抗血清两种免疫制剂免疫后，试验动物均没有出现不良症状。说明两种抑制素α抗原均可对哈萨克羊血液生殖激素的分泌产生良好效果，相比之下抑制素α抗血清免疫效果更佳。 相似文献
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Cytokine responses in camels (Camelus bactrianus) vaccinated with Brucella abortus strain 19 vaccine
Odbileg R Purevtseren B Gantsetseg D Boldbaatar B Buyannemekh T Galmandakh Z Erdenebaatar J Konnai S Onuma M Ohashi K 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2008,70(2):197-201
In the present study, we determined the levels of cytokines produced by camel (Camelus bactrianus) peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in response to live attenuated Brucella abortus (B. abortus) S19 vaccine. Seven camels were vaccinated with commercial B. abortus S19 vaccine, and their cytokine responses were determined using a real-time PCR assay. Cytokine responses to B. abortus S19 were examined at 6 hr, 48 hr and 1, 2 and 3 weeks post-vaccination. Serological tests were performed to further confirm these immune responses. The results revealed that IFN-gamma and IL-6 were upregulated during the first week post-vaccination. Low level expressions of IL-1alpha, IL-1beta, TNFalpha and IL-10 and no expression of IL-2 and IL-4 were observed compared with the control camels. The findings showed that B. abortus stimulates cell-mediated immunity by directly activating camel Th1 cells to secrete IFN-gamma. This quantification of cytokine expression in camels is essential for understanding of Camelidae disease development and protective immune responses. This is the first report of in vivo camel cytokine quantification after vaccination. 相似文献
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为获得分泌抗大豆凝集素(SBA)单克隆抗体的杂交瘤细胞,以纯化的SBA为抗原,免疫BALB/c小鼠,加强免疫3 d后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,应用有限稀释法和间接ELISA 方法克隆筛选出2株分泌抗SBA单克隆抗体的杂交瘤细胞系A7、F12。细胞上清抗体效价均在1∶2×103以上,腹水抗体效价均为1∶1×106,单抗亚型鉴定结果均为IgG2b型,分子质量为189.6 ku,亲和常数为7.1×107 mol/L,Western blotting结果表明,2株单抗具有较高的特异性。该McAb的制备为建立SBA定量检测方法奠定了基础。 相似文献