共查询到20条相似文献，搜索用时 187 毫秒
1.
中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定 总被引：11，自引：0，他引：11
应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。 相似文献
2.
为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献
3.
传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。 相似文献
4.
利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。 相似文献
5.
应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714 bp,GenBank登录号:GU363950。对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性。VP1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 相似文献
6.
《中国家禽》2016,(17)
根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
7.
鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
8.
利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。 相似文献
9.
10.
为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性. 相似文献
11.
参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的AppDNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3’端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD-ApxⅣ进行BamHI、HindIII双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组表达质粒pET-ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET-ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39.5KDa。利用HiTrapFFcrude columns将表达的蛋白进行了纯化。 相似文献
12.
参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的App DNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3′端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD—ApxⅣ进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建了重组表达质粒pET—ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET—ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39．5KOa。利用HiTrap FF crude columns将表达的蛋白进行了纯化。 相似文献
13.
为研究简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原的免疫特性,本研究提取了线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增肌钙蛋白类过敏原(Anis1)基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后将anis1基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白。通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,融合蛋白采用Western blotting分析。将纯化的Anis1重组蛋白免疫小鼠,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。酶切和DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组Anis1蛋白,重组蛋白经Western blotting分析证实为目的蛋白,纯化蛋白Anis1免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组蛋白Anis1能被免疫血清识别,说明简单异尖线虫重组蛋白Anis1具有较好的免疫原性和免疫反应性。 相似文献
14.
15.
构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。 相似文献
16.
为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
17.
猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用 总被引：11，自引：3，他引：11
根据GenBank中A/Swine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品.经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD.用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应.正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应.通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上.试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求.目前正在进行现地的中试试验. 相似文献
18.
试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。 相似文献
19.
NIE Xin ZHAO Tian-jing CAO Rui-yong PENG Dong-mei LI Guo-hua LI Ya-ying XU Kai-lian ZHU Hua-pei PANG Feng WANG Feng-yang DU Li 《中国畜牧兽医》2016,43(7):1681-1687
The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively. 相似文献
20.
提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。 相似文献