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1.
将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。 相似文献
2.
鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种严重危害养禽业的高度致死性和免疫抑制性传染病。为研制IBD重组火鸡疱疹病毒（HVT）活载体疫苗,本研究构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）保护性抗原VP2基因的重组HVT并对其体外生物学特性进行了分析。通过RT-PCR扩增IBDV超强毒株VP2基因并克隆入pCI载体,获得重组真核表达质粒pCI-VP2。用限制性内切酶将携带CMV启动子的VP2基因表达框架切下,连接于入门质粒pENTR,构建获得重组入门质粒pENTR-VP2。将pENTR-VP2与HVT重组黏粒H3-Kan/ccdB进行LR重组反应,构建重组表达黏粒H3-VP2。用H3-VP2与其他4个相互重叠并覆盖HVT全基因组的黏粒共同转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,拯救获得重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF中连续传至20代后用PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行检测,并绘制重组病毒体外生长曲线,分析其体外复制特性。结果表明,重组病毒rHVT-VP2能够稳定表达VP2蛋白,rHVT-VP2在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。重组病毒rHVT-VP2免疫鸡后能够诱导产生IBDV中和抗体,并对IBDV强毒株攻击引起的死亡提供90%免疫保护。重组病毒rHVT-VP2的构建为研制IBD重组HVT活载体疫苗奠定了基础,对IBD的防控具有重要意义。 相似文献
3.
为构建表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组疱疹病毒(HVT),本研究将AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表达质粒中,构建了转移载体pUAB-gpt-HA。通过同源重组及霉酚酸筛选技术,将HA基因表达盒插入到HVT US10基因区,构建了一株表达H5亚型AIV HA基因的重组病毒HVT(rHVT-US10-HA)。经PCR、间接免疫荧光、western blot及红细胞凝集试验鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。rHVT-US10-HA的构建为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90。通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株。将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性。结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异。PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在。IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白。体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义。 相似文献
5.
采用PCR方法，以传染性贫血病毒(CIAV)DNA为模板，扩增并克隆了CIAV的VP1、VP2基因，并进行了序列分析。经基因修饰，将这两个基因分别加上表达元件后连接作为目的基因。通过同源重组技术，将目的基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)gC基因区，构建了一株含CIAV VP1、VP2基因表达单元的重组HVT(VP1VP2-rHVT)：体内、体外传代结果表明该重组病毒性状稳定。采用PCR扩增及Southem blot杂交检测，证实了CIAV VP1、VP2基因的插入。 相似文献
6.
共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
7.
通过不同方法注射一定剂量的疫苗同时抗多种病原,是目前禽类免疫的一个难题。本研究以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体表达高致病性H7N1禽流感病毒血凝素(HA)抗原构建同时抗禽流感和马立克氏病的二价活载体疫苗。利用传染性细菌人工染色体(BAC)克隆技术构建HVT载体。改造携带HTV基因组的BAC,使其表达高致病性H7N1病毒的HA基因,将其转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救病毒,获得HTV重组体(rHVT-H7HA)。通过分析感染rHVT-H7HA的CEF可知,rHVT-H7HA表达了HA蛋白,且rHVT-H7HA在体外稳定,经多次传代后其在生长动力学上与HTV相同。1日龄雏鸡接种rHVT-H7HA后,能诱导H7特异性抗体,并使攻毒鸡获得对H7N1的特异性保护。接种rHVT-H7HA的鸡中可检测到核蛋白特异性抗体,因此能区分受感染动物和接种疫苗的动物。rHVT-H7HA不仅能对高致病性H7N1病毒和马立克氏病毒强毒的攻毒提供保护,还能作为DIVA疫苗使用。 相似文献
8.
本试验采用以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β—半乳糖苷酶(LacZ)基因作为报告基因,将其插入到含有火鸡疮疹病毒(HVT)糖蛋白A(gA)抗原基因的克隆片段中,构建成HVT转移载体质粒,在该转移载体质粒中,大肠杆菌LacZ基因的两端分别与两段1.4kb和1.8kb的HVT同源片段相连,克隆于pUC19质粒中,将含有LacZ基因的载体质粒与感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取的全细胞DNA共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,用含有X-gal的琼脂糖覆盖细胞单层,可见到有兰色的病毒蚀斑,这些结果表明外源性的LacZ基因已被重组到HVT DNA中,同时还证明HVT的gA基因与HVT的复制无关,可以用于外源基因的插入和表达。 相似文献
9.
为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HVT重组病毒,并在体外评价该重组病毒的相关特性。结果表明,转染细胞后成功获得HVT重组病毒。通过Western blot和IFA分析表明,重组病毒表达了PmpD-N蛋白。Confocal分析表明,PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。HVT重组病毒的复制特性和野生型HVT一致。HVT重组病毒能够激活巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6和NO的产生。该试验成功构建了含有CMV启动子,能够表达PmpD-N蛋白的HVT重组病毒,为下一步进行动物试验和分析该病毒的免疫效力奠定了基础。 相似文献
10.
将新城疫病毒（NDV）F48E9株融合蛋白（F）基因1700bp克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建成表达F基因的载体pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒（HVT）非必须片段载体pTK2B中，构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒体pTK3F。经限制性内切酶酶切分析，F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础。 相似文献
11.
《中国家禽》2021,(6)
试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建。通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(Ds Red)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒p AI4-2FHN-GRFP。该质粒与p CI-NP、p CI-P和p CI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞后,获得可同时表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组新城疫病毒。拯救病毒在SPF鸡胚中繁殖传代,通过RT-PCR验证,并检测重组病毒的生物学活性和外源蛋白的表达效率。结果显示:重组病毒在鸡胚内传3代后,鸡胚尿囊液HA效价稳定在8 log_2,感染细胞24 h、36 h、48 h后在荧光显微镜下观察到EGFP与Ds Red的荧光亮度逐渐增强,且相同时间内红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白表达量相似。重组病毒的构建为新城疫病毒作载体用于多联多价疫苗的研发提供了参考。 相似文献
12.
《中国家禽》2017,(1)
启动子在重组火鸡疱疹病毒(HVT)载体疫苗中起着至关重要的作用,内源性启动子活性较弱,受载体病毒自身的复制调控。研究通过预测分析HVT(FC126株)囊膜糖蛋白(g B)启动子,将其克隆并与经密码子优化的H7N9亚型禽流感病毒的HA基因构建表达盒质粒,再进一步通过间接免疫荧光试验和荧光定量PCR比较其与外源性强启动子CMV和马立克氏病病毒(MDV,CVI988株)g B启动子的转录表达活性。结果表明:3种启动子均能使目的基因在体外获得转录表达,CMV启动子的活性高于内源性g B启动子,而HVT的g B与MDV的g B表达活性差异不显著。研究结果为重组HVT载体疫苗启动子的选择提供了一定参考。 相似文献
13.
《畜牧与兽医》2017,(9):83-87
为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-VP2-A/BL21、p ET-28a(+)-VP2-B/BL21、p ET-28a(+)-VP2-C/BL21进行表达,获得3段VP2蛋白,分别命名为VP2-A、VP2-B、VP2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,VP2-A、VP2-B、VP2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒VP2蛋白的分段表达为VP2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。 相似文献
14.
表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
15.
《中国家禽》2016,(17)
根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
16.
A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2015,(3)
为构建含H3N8马流感(EIV)HA基因的噬菌体病毒样颗粒(VLPs),本研究将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中,构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的重组质粒p NH-MS2his。并通过RT-RCR技术扩增H3N8亚型EIV的HA基因,将其克隆于p NH-MS2his中,构建原核重组表达质粒p NH-MS2his-H3,并将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs,其中含有H3N8亚型EIV的HA基因RNA序列,并且该RNA序列具有良好的稳定性,可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及海关样品检测。 相似文献
18.
采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA. 相似文献
19.
《中国预防兽医学报》2019,(1)
为构建一株表达狂犬病病毒(RV) G蛋白的重组犬瘟热病毒(CDV),本研究以本实验室分离的CDVSnyder Hill疫苗株为基础,在CDV P和M基因之间插入RV弱毒疫苗株ERA G蛋白基因,构建重组质粒p CI-CDV-RVG及表达CDV N、P和L蛋白的辅助质粒p CI-CDVN、p CI-CDVP和p CI-CDVL,将重组质粒和辅助质粒共转染BSR细胞,拯救获得了表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒(rCDV-RVG),将该重组病毒在Vero细胞中传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定。结果显示RV G基因能够在r CDV-RVG中稳定存在并正确表达。病毒生长动力学曲线显示,重组病毒在Vero细胞中的增殖效率与拯救的亲本病毒r CDV无显著差异(p0.05)。本研究表明CDV Snyder Hill株作为载体表达外源基因的潜力,为研制高效、安全、廉价的CDV-RV二联活载体疫苗奠定基础。 相似文献
20.
【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV） VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒（Human adenovirus serotype-5，HAdV-5），以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2；PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞，利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2；将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞，包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5（rAd5-VP2），将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞（Vero、CEF和DF1细胞）并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养，测得第10代病毒的滴度为7.9×109 IFU/mL；RT-PCR结果显示，VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译；Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达，蛋白分子质量为41 ku；将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达，表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5，该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 相似文献