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1.
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
2.
《现代畜牧兽医》2019,(12)
研究克隆PCV2 SY株ORF2基因序列,对N端细胞核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)区域11个氨基酸进行点突变,突变后的ORF2基因先后克隆至pUC57和转移载体pBacF,经PCR及酶切鉴定正确后,转染sf9细胞获得重组杆状病毒,重组杆状病毒在Hi5细胞进行感染及cap蛋白表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,在Hi5细胞28 kDa处有一可被PCV2阳性血清识别的外源cap蛋白高效表达;Hi5细胞中的cap蛋白产量比sf9细胞中产量高,而且比较稳定,均达到350～550μg/mL;同时经蛋白测序得出,上述蛋白序列与NCBI数据库PCV2病毒cap序列配对率达93.59%以上。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2017,(2):218-223
采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。 相似文献
4.
试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTAORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。 相似文献
5.
猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。 相似文献
6.
为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献
7.
猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
8.
采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
9.
猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。 相似文献
10.
为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
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试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。 相似文献
12.
参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。 相似文献
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利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。 相似文献
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将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
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根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。 相似文献
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以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引：3，自引：1，他引：3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献
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为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献