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1.
【目的】探讨牛IL-18(BoIL-18)对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】PCR扩增BoIL-18蛋白基因片段,将其定向克隆至pcDNA3.1载体中,构建牛IL-18真核表达质粒pcDNA3.1-BoIL18。将pcDNA3.1-BoIL18与FMD灭活疫苗联合免疫小白鼠,同时设空载体和单纯接种FMD灭活苗组为对照,通过对口蹄疫抗体效价的检测、T淋巴细胞转化试验及NK细胞活性检测试验,研究BoIL18对FMD灭活疫苗的免疫增强作用。【结果】同时接种FMD灭活疫苗和IL-18真核表达质粒的小白鼠T淋巴细胞转化率和NK细胞活性,从接种第21天开始均明显高于单纯FMD灭活苗接种组(P<0.05),所产生的中和抗体效价从第28天开始与单纯接种FMD灭活疫苗组差异显著(P<0.05);空载体组与单纯FMD灭活疫苗组上述3项指标间无显著差异。【结论】牛IL-18真核表达质粒在小白鼠体内得到了良好表达,且表达产物对FMD灭活疫苗的免疫效果具有明显的增强作用。 相似文献
2.
【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV VP2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和VP2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2,表达出可溶性蛋白Cap和VP2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV VP2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV VP2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、VP2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。 相似文献
3.
[目的]构建口蹄疫DNA疫苗[方法]构建以PRV为载体的表达FMDV P1基因的质粒pIESZP1和pUTK3CP1,免疫小鼠并检测了免疫后小鼠的抗体水平.将构建的2个真核表达质粒分别转染Vero细胞,通过PCR、IFA、Western-blot等方法检测目的基因的转录和表达.将正确表达目的基因的DNA质粒肌肉接种3周龄的Balb/C小鼠,采用ELISA和SN方法检测了免疫小鼠体内的抗体水平.[结果]携带有FMDV衣壳蛋白P1基因的DNA质粒能引起小鼠产生特异性的体液免疫反应,两重组质粒诱导小鼠产生抗FMDV的抗体水平无差异.[结论]该研究为含有FMDV P1基因重组PRV以及重组病毒的动物免疫试验以评价基因工程疫苗的免疫效果奠定了基础. 相似文献
4.
将人工合成的O型口蹄疫病毒主要表位基因与结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中,以电穿孔法转化酵母菌X-33,用Zeocin平板筛选重组子,PCR鉴定后甲醇诱导表达.SDS-PAGE显示,其相对分子质量为89 000,表达量约为190 mg·L-1;免疫印迹分析证实表达产物具有免疫反应性.融合蛋白以皮下接种的方式对8只小鼠进行3次免疫,然后通过ELISA和MTT分别检测抗体水平和淋巴细胞增殖反应.结果表明,融合蛋白既能诱导细胞免疫应答,又能诱导体液免疫应答,其产生的抗体水平接近于常规灭活疫苗.MTT试验结果显示,融合蛋白的A570为0.381±0.072,灭活疫苗的A570为0.340±0.050,表明融合蛋白的细胞免疫应答水平高于后者.提示,hsp70作为分子佐剂在口蹄疫基因工程疫苗研究中具有很好的应用前景. 相似文献
5.
为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。 相似文献
6.
《甘肃农业大学学报》2019,(5)
【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19~+CD27~+CD38~+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂. 相似文献
7.
以小鼠脾脏cDNA为模板，用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒，在37℃诱导表达，重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子，制备特异性多克隆抗体；测定多克隆抗体的效价达到1∶4 096 000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体，为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。 相似文献
8.
比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗.将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6～8周龄昆明白小鼠, 用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能.结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量（OD值为0.575 4）明显高于pVP22-E2n（OD值为0.306 05）（P〈0.05）;proVAX-E2n刺激机体产生的抗体水平（最高抗体滴度为1：2 200）显著高于pVP22-E2n免疫组（最高抗体滴度1：1 600）;淋巴细胞增殖结果显示proVAX-E2n（刺激指数4.073）与pVP22-E2n（刺激指数2.205）相比,能诱发小鼠产生更强的CSFV的特异性淋巴细胞增殖反应.本研究表明proVAX真核表达载体对E2基因体外表达效率和小鼠免疫效果均高于pVP22真核表达载体. 相似文献
9.
猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
为制备猪瘟病毒(CSFV)特异性诊断抗原,根据国内CSFV流行毒株的序列合成了其主要的保护性抗原Erns蛋白的基因序列,将合成的基因按设计的酶切位点与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-Erns.用SalI将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌.经筛选、鉴定,成功获得了表达CSFV的Erns蛋白的阳性重组酵母菌.该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白.Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别CSFV抗体,且具有很好的反应原性. 相似文献
10.
为研究水溶性酵母葡聚糖作为免疫佐剂对猪细小病毒(PPV)灭活疫苗免疫效果的影响,将水溶性酵母葡聚糖与PPV灭活疫苗联合免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠血清中的抗体水平及IL-4、IL-6、IFN-γ的分泌水平,应用流式细胞仪检测免疫小鼠CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞百分比值的动态变化。结果显示,与疫苗单独免疫组相比,酵母葡聚糖对抗体水平无明显影响,CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+细胞数量增加,且均能不同程度诱导IL-4、IL-6、IFN-γ分泌。表明,水溶性酵母葡聚糖联合PPV灭活疫苗能够有效增强机体的免疫功能,水溶性酵母葡聚糖可以作为PPV的免疫佐剂。 相似文献
11.
旨在研究猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,简称Mhp)纤毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白(flagellin,简称F)-霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit,简称CTB)2种重组蛋白对口蹄疫(foot-and-mouth disease,简称FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。通过体外表达获得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1 2种重组蛋白,用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)方法检测pCold-F7-CTB蛋白的生物学活性,将重组蛋白分别与口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,简称FMDV)灭活抗原、口蹄疫灭活疫苗混合制备,皮下或腹腔接种Balb/c小鼠,共免疫2次,间隔3周。分别于免疫前、免疫后21、35、49 d采血,49 d后无菌摘取脾脏。采用阻断ELISA的方法检测小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白(IgG)抗体滴度,用流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例,以评估免疫效力。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析结果表明,2种重组蛋白成功表达。用GMl(神经节苷脂)-ELISA方法验证pCold-F7-CTB的生物学活性,发现融合蛋白F7-CTB保留了与GMl的结合能力。小鼠免疫试验结果表明,经皮下注射接种后,单独口蹄疫病毒灭活抗原组没有产生明显的抗体水平,而F7-CTB免疫增强剂组比单独口蹄疫病毒灭活抗原组的IgG滴度更高。在试验中发现,当重组蛋白与口蹄疫灭活疫苗联合使用时,血清中的IgG滴度明显增高,CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果最佳。可以初步得出,免疫增强剂P97和F7-CTB具有协同作用,皮下注射可显著提高FMD的特异性IgG水平,CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值升高,显示其具有良好的应用前景。 相似文献
12.
《江苏农业学报》2014,(3)
试验旨在制备鼠抗鸡Toll样受体2(chTLR2)的多克隆抗体。采用RT-PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外区片段chTLR2(chTLR2t1和chTLR2t2),并构建这两个片段的原核表达重组质粒,优化蛋白质的表达条件,SDS-PAGE和Western-blot法检测融合蛋白,将融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用相应的原核表达的全长蛋白检测特异性抗体滴度。结果显示,成功获得chTLR2的胞外区片段,构建的原核表达重组质粒经IPTG诱导能成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价分别为1∶16 000和1∶10 000。表明制备的鼠抗chTLR2多抗具有良好的特异性,为进一步研究chTLR2的功能提供了重要材料。 相似文献
13.
《江苏农业科学》2014,(7)
用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,HA蛋白表达分子量约为70 ku;将HA蛋白制成油乳液,免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫。试验结果表明:重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后,血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS组,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组,而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫,能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。 相似文献
14.
目的 获得可稳定表达猪O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)抗原表位融合结构蛋白VP1的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1),制备亚单位疫苗。方法 设计合成含FMDV抗原表位与VP1基因序列的重组基因RP1,将其克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中,将构建的重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染HEK-293T细胞,获得重组慢病毒HIV-RP1;将收获的病毒液感染CHO-K1细胞,经筛选获得单克隆细胞株,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定,获得可表达RP1的阳性细胞株,命名为CHO-K1-RP1;将CHO-K1-RP1连续传30代,每隔5代收获相同数量的细胞样品进行Western blot鉴定。结果 IFA结果显示,表达RP1的细胞发出绿色荧光,而空白对照无绿色荧光;Western blot结果显示,在约55 kU处能观察到清晰的条带;表明成功获得了融合蛋白。将获得的融合蛋白与佐剂等体积混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠,抗体检测结果显示,二次免疫后,该亚单位疫苗组与口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)商品化灭活疫苗组小鼠之间抗体水平无显著差异,两者抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论 本研究构建的亚单位疫苗能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应,为猪口蹄疫新型疫苗的研制提供了参考。 相似文献
15.
猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。 相似文献
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白细胞介素-10分子佐剂增强口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫效果研究 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】研究白细胞介素-10作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）的黏膜免疫应答。【方法】利用RT-PCR技术以Balb/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,扩增出小鼠的IL-10基因,并构建真核表达质粒proVAX-IL-10, 通过鼻腔接种方式,将口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）和真核表达质粒（proVAX-IL-10）共同免疫小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位（肺脏、生殖道）sIgA滴度,免疫组织化学法检测气管、生殖道和小肠中sIgA 的表达情况,CSFE染色法检测小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平,用胞内细胞因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4+阳性T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。【结果】成功构建了proVAX-IL-10真核重组质粒,且重组质粒可以在BHK细胞中有效表达;将proVAX-IL-10与口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1共同免疫小鼠后发现,与单独接种pcD-VP1相比,加入IL-10分子佐剂后,可以诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌,极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应水平以及CD4+ T细胞中IL-4的表达量。【结论】IL-10作为分子佐剂,通过鼻腔黏膜免疫后,可以有效增强机体对口蹄疫DNA疫苗的黏膜免疫应答,对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。 相似文献
17.
【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。 相似文献
18.
【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。 相似文献
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Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预计融合蛋白大小一致,融合蛋白经电洗脱纯化后免疫小鼠,间接ELISA显示抗体效价达到1∶4000,淋巴细胞增殖试验表明与空白组相比,Luman-N-端融合蛋白质量浓度为10、20、40和60μg/mL时,能显著刺激淋巴细胞的增殖(P<0.05);质量浓度为80、100μg/mL能极显著地刺激淋巴细胞的增殖(P<0.01)。 相似文献
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为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。 相似文献