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1.
本试验旨在研制小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据小鹅瘟和鹅病毒性肠炎基因序列,设计合成一对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期进行研究,之后进行临床扩大试验。该二联PCR诊断试剂盒能扩增出预期的小鹅瘟375 bp核酸片段和鹅病毒性肠炎223 bp核酸片段,与鸭瘟病毒、鹅副黏病毒无交叉反应;最低能检测到小鹅瘟病毒104 ELD50/mL,雏鹅新型病毒性肠炎病毒2.5×10-1ELD50;不同批次的试剂盒对同一样品检测结果一致;常温下至少可保存5个月;临床应用效果显著。该二联PCR检测试剂盒能够对小鹅瘟和雏鹅病毒性肠炎早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。 相似文献
2.
为建立一种快速、敏感、特异的猪弓形虫检测方法,根据弓形虫保守基因序列,设计一套特异性引物和FAM荧光素标记的MGB探针;通过对PCR反应体系和反应条件进行优化筛选,建立了猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法,并对此PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对60份疑似弓形虫感染的临床样品进行了检测。结果显示:建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法在101～107拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对弓形虫重组阳性质粒出现阳性扩增信号,但对阴性对照的水和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自60份疑似猪弓形虫感染样品中检出32份阳性,并且和克隆测序结果一致。结果表明,本研究建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法可用于猪弓形虫的快速检测,从而为猪弓形虫病的诊断提供了特异、敏感、高通量的方法。 相似文献
3.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒的研制 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因序列,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为600 bp,特异性与敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为50 CFU/mL,而对金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。-20℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对41份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与细菌学检测结果相一致。结果表明,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒能够对APP临床样品进行快捷、灵敏、准确的检测。 相似文献
4.
猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立 总被引：11，自引：2，他引：11
以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记．建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型．摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示，该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子的DNA，且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应，证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明．在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5d)．对取材的8个组织样品用该PCR方法检测，有6个组织样品为阳性，其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。 相似文献
5.
《中国预防兽医学报》2016,(2)
为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列(AF092924.1)设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。 相似文献
6.
为建立猪源产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的快速准确诊断方法,根据Gen Bank收录的ETEC耐热肠毒素(STⅡ)基因序列设计1对特异性引物,采用SYBR GreenⅠ荧光染料建立ETEC荧光定量PCR诊断试剂盒,并验证该检测法的敏感度、特异性、重复性及试剂盒长期保存的稳定性。结果显示:该诊断试剂盒的最低灵敏限度达1.0×101拷贝/μL,特异性强,对羊源、牛源产肠毒素性大肠杆菌基因未检出;用该试剂盒检测猪场分离的149株临床样品,同时与传统的分离培养后普通PCR比较,该方法检出率高;试剂盒于-20℃保存3~6个月对阳性标准品拷贝数无影响。本研究研制的试剂盒在临床检测大肠杆菌比传统检测方法快且结果表明建立的试剂盒适合于ETEC的检测,为该病的快速诊断和防治提供基础。 相似文献
7.
《中国动物传染病学报》2018,(5)
弓形虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。为了比较不同试剂盒提取猪肉中弓形虫DNA的效率和质量及对弓形虫PCR检测的影响,本试验采用6种商品化基因组DNA提取试剂盒,对添加了不同数量弓形虫速殖子的猪膈肌样品进行DNA提取,作为模板,进行PCR检测,观察不同试剂盒提取DNA的扩增效果。结果显示,EZNA Tissue DNA Kit、TIANamp Genomic DNA Kit和FastDNA Spin Kit for Soil三种方法对含有1×101个以上数量速殖子的猪膈肌样品提取的DNA,均能被检测为阳性;TIANamp Genomic DNA Kit提取的DNA作为模板进行PCR检测,其扩增特异性良好。利用TIANamp Genomic DNA Kit对126份上海屠宰场采集的猪膈肌样品进行DNA提取,作为模板进行PCR检测,结果阳性率为3.97%(5/126),表明TIANamp Genomic DNA Kit提取猪肉中携带的弓形虫DNA具有高效、稳定、价廉的优点,适合田间猪肉中携带弓形虫的调查研究应用。 相似文献
8.
为了比较猪瘟病毒6种荧光PCR检测试剂盒的使用效果,本研究采用标准毒株、疫苗与猪瘟阳性组织3类样品,对这些试剂盒的敏感性、特异性、重复性及有效期符合率进行比较。结果显示,试剂盒差异较大,仅有国外试剂盒和2家国产试剂盒与预期的结果一致,其对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型以及阴性猪样品的核酸无交叉反应,重复性与再现性均为理想,在有效期内检测结果没有发生变化。本研究开展检测猪瘟病毒试剂盒验证试验,这将为猪瘟的病原学诊断及实验室开展其它试剂盒验证提供参考。 相似文献
9.
以纯化的猪附红细胞体特异性抗原为包被抗原,在建立猪附红细胞体病间接ELISA检测方法的基础上对各反应参数进行了优化,并初步组装成试剂盒。组装的试剂盒抗原最佳包被质量浓度为30 mg/L,被检血清稀释度为1∶100,酶标二抗的最适工作滴度为1∶4 000,底物TMB最适反应条件为室温15 min;检测血清的判定标准为D450值≥0.13定为阳性反应,D450值≤0.11定为阴性反应,0.11~0.13定为疑似反应;该试剂盒不与猪大肠杆菌病、猪弓形虫病及猪瘟等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;在不同时间对阴阳性样品重复检测8次,阴阳性血清的D450值变异系数均未超过10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;通过对组装试剂盒中各组分的稳定性和保存时间的测定结果证实,该试剂盒的保质期暂定为6个月;应用保存6个月的试剂盒通过对吉林省延边地区的60份猪血清样本检测,并与间接ELISA比较,其阳性符合率达100%,说明该试剂盒具有较好的稳定性。 相似文献
10.
以猪弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列为模板自行设计引物,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法,并从弓形虫国际标准强毒株RH速殖子和疑似T.gondii感染猪全血及肺脏组织样品基因组DNA中扩增出了预期长度273bp的目的DNA片段。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法能检测到的最低DNA量为0.001ng,且与相关的9种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。用建立的PCR诊断方法对临床30份猪弓形虫疑似病料和60份健康猪抗凝全血样品进行检测,结果30份病料中有24份呈现阳性;60份健康猪血中有5份为阳性;随机取两个临床样品的阳性PCR扩增片段进行克隆测序表明,二者序列与Gen-Bank中已登录的猪弓形虫ITS1基因相应部分序列完全相同。以上表明所建立的PCR方法具有高度的敏感性和特异性;本研究为猪弓形虫病的快速诊断提供了一种新方法。 相似文献
11.
鸡毒支原体PCR检测试剂盒的研制与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据基因库中鸡毒支原体 1 6SrRNA的序列研制PCR检测试剂盒 ,用于检测鸡毒支原体 (MG)。结果表明该MG PCR检测试剂盒对不同MG参考菌株和地方分离株均能特异性地扩增出 732bp条带 ,而对其他禽支原体和禽病病原体的扩增结果为阴性。该MG PCR试剂盒最低能检测出 1 0 0fg的MGDNA模板。保存期测定结果表明 ,该MG PCR试剂盒在 - 2 0℃条件下保存至 1 ,3 ,6和 9个月时 ,其敏感性无明显变化 ,仍能检测到 1 0 0fg至 1pg的MGDNA模板。保存至 1 2个月时其敏感度虽降低了 1个滴度 ,但仍能 1 0 0 %检出人工感染鸡的临床样品 相似文献
12.
根据GenBank中的牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒,该试剂盒扩增的阳性条带为317 bp;敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为1.025 pg/μL;特异性试验表明,仅结核分枝杆菌扩增结果为阳性,副结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌的扩增结果均为阴性。-20 ℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对24份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与结核菌素试验检测结果相一致。结果表明,牛结核病PCR检测试剂盒能够对牛结核临床样本进行快捷、灵敏、准确的检测。 相似文献
13.
为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型（FAdV-4）检测试剂盒，本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针，并在下游引物标记FITC，探针标记Biotin，应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术（LFD），优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法，并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明，此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4，而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克病病毒（MDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H9亚型（AIV（H9））、禽呼肠孤病毒（ARV）、FAdV标准株（FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11）、鸡大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（SA）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、鸡毒支原体（MG）的检测结果均为阴性。敏感性试验表明，此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融，依然有很好的检测效果。保存期试验证实，试剂盒在4 ℃条件下至少可以保存3个月，在-20 ℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化，简化了操作流程，提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示，FAdV-4阳性率为17.95%（21/117）。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查，对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。 相似文献
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检测实验动物弓形虫感染的两种PCR方法的建立和比较 总被引：5，自引：1，他引：4
为了建立敏感、稳定、特异的PCR检测体系，用于实验动物弓形虫感染的检测。采用B1基因设计引物，建立常规PCR，用P30基因设计引物，建立巢式PCR；用两种PCR方法检测实验感染弓形虫小鼠血液和腹腔波中的DNA动态变化；用巢式PCR检测自然状态下的普通级豚鼠、教学和科研用兔的弓形虫感染率，并和常规PCR检到结果比较。结果，巢式PCR可检测到1fgDNA含量，比常规PCR敏感lOO倍；对其他微生物DNA无交叉现象，特异性强；对同一样品重复检测3次，阴、阳性结果一致，稳定性好。小鼠感染弓形虫2d后，巢式PCR对小民腹腔液的阳性检出率为83．3％，对血液的阳性检出率为33．3％；感染3d后，腹腔液阳性检出率为100％；而常规PCR在小鼠感染3d和4d后才能在腹腔液和血液中检测到，检出率各为16．7％。受检普通级豚鼠没有感染弓形虫，教学和科研用兔的弓形虫总感染率为14．3％。结论认为，巢式PCR方法可用于实验动物弓形虫早期感染的检测，具有敏感性高、特务性强、稳定性好的特点。 相似文献
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采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献
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安氏隐孢子虫PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：1
经BLAST检索,以HSP70基因设计一对引物(5'-CAATCGAATTGGATTCTTTGTC-3'和5'-CACCTTCAAAT-ACTTGAATAAGT-3')对奶牛安氏隐孢子虫进行了PCR试验.结果显示所建立的PCR检测方法只能特异扩增隐孢子虫GD株DNA,而对照样本如微小隐孢子虫、弓形虫、圆孢子虫、纤毛虫、肝片吸虫、血矛线虫、莫尼茨绦虫、牛粪便以及大肠杆菌均为阴性;通过对6个浓度梯度的虫体DNA进行PCR反应,结果表明当样本中含有445个隐孢子虫卵囊的DNA时,即可扩增产生清晰可辩的条带.测得该序列长度为494bp,序列分析为牛型C.andersoni.表明该引物能特异扩增C.andersoni,敏感性较高,适合于奶牛安氏隐孢子虫的检测. 相似文献
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为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感H9检测方法,本研究根据GenBank中收录的禽流感H9病毒高度保守的基因序列,设计1对H9的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的PCR,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感H9病毒一步法RT-PCR检测方法,在此基础上完成了试剂盒的组装,对30份疑似禽流感病料的检出率高达98%以上,检测灵敏度达101.5ELD50,稳定性良好, 冷冻保存期达12个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。 相似文献