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1.
表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体 相似文献
2.
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
3.
以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。 相似文献
4.
应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。 相似文献
5.
核蛋白基因（N）位于犬瘟热病毒基因组的108—1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAX△E3LPN。以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变。电镜负染、切片观察,酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa。 相似文献
6.
通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子（pE／L）、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp（Locus of X-overP1）序列的表达盒构建穿梭质粒pTE—EGFP。利用pTE—EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞（BHK-21）,通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E31．基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE-EGFP＋利用rTTVV—TE-EGFP＋和含有Cre（Cyclization recombination）重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV—TE一,并利用聚合酶链式反应（PCR）对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE-中无ESI。基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV—TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。 相似文献
7.
采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒（AIV）A／GOOse／Guangdong／1／96（HSN1）株的核蛋白（NP）基因，将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX—NP阳性克隆转染Hela细胞，48h后经间接免疫荧光试验和Western—blotting检测，NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57ku，它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。 相似文献
8.
本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2为基础,以8202株狂犬病病毒基因组为模板,通过PCR扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因(8202-G″)。通过MluⅠ和EcoRⅠ双酶切pPolyⅡ-CAV-2质粒,获得含有Ⅸ蛋白的340bp片段,将其克隆入pEGFP-C1-dAseⅠ质粒中,构建pEGFP-SIX载体,该载体经AseⅠ单酶切插入8202-G″,即在编码Ⅸ蛋白基因的最后密码子与终止密码子之间按与Ⅸ蛋白编码链相同转录方向插入8202-G″基因,获得重组基因组质粒和pPolyII-CAV-2-ⅨG(34.8kb)。酶切鉴定结果显示,目的基因均克隆进Ⅸ蛋白中。 相似文献
9.
减毒沙门菌运送的H9N2亚型禽流感病毒DNA疫苗的研制及其免疫试验 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中已发表的H9N2亚型AIV HA基因序列设计并合成一对PCR引物,通过RT-PCR扩增A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株的HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asd-pVAX1得到重组表达质粒pVAX1-HA和asd-pVAX1-HA.将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达.进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207和X4550,得到两种运送DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA).以5×109 cfu/只的剂量两次口服接种1日龄的商品代伊莎褐蛋鸡,免疫鸡既能检测到HA特异性的血清抗体应答,又能检测到黏膜免疫应答,采用A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株经滴鼻和口服同时攻毒免疫鸡后,这两种疫苗抑制免疫鸡排毒的效果与灭活疫苗有显著差异. 相似文献
10.
《畜牧与兽医》2021,(6)
为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl; Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。 相似文献
11.
本研究从一株鼠仙台病毒（Sendai virus,SeV）中扩增获得核蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将其克隆入pET32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明：该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
12.
对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。 相似文献
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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表述.本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础. 相似文献
15.
J.-X. Zhou J.-D. Xue T. Yu J.-B. Zhang Y. Liu N. Jiang Y.-L. Li R.-L. Hu 《Veterinary research communications》2010,34(4):371-380
To develop a new type vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) prevention by using canine adenovirus
2(CAV-2) as vector, the Glycoprotein 5(GP5) gene from PRRSV strain JL was amplified by RT-PCR, and the expression cassette
of GP5 was constructed using the human cytomegalovirus (HCMV) promoter and the simian virus 40 (SV40) early mRNA polyadenylation
signal. The expression cassette of Glycoprotein 5 was cloned into the CAV-2 genome in which E3 region had been partly deleted,
and the recombinant virus (CAV-2-GP5) was obtained by transfecting the recombinant CAV-2-GP5 genome into MDCK cells together
with Lipofectamine™ 2000. Immunization trial in pigs with the recombinant virus CAV-2-GP5 showed that CAV-2-GP5 could stimulate
a specific immune response to PRRSV. Immune response to the GP5 and PRRSV was confirmed by ELISA, neutralization test and
lymphocyte proliferative responses, and western blotting confirmed expression of GP5 by the vector in cells. These results
indicated that CAV-2 may serve as a vector for development of PRRSV vaccine in pigs, and the CAV-2-GP5 might be a candidate
vaccine to be tested for preventing PRRSV infection. 相似文献
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马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
18.
为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI3806全基因组序列（登录号为NC015153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。 相似文献
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对河南省鸡源大肠杆菌Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子及其携带的耐药基因盒进行了分子流行病学研究。结果表明：51株鸡源大肠杆菌中86．3％（44／51）检出Ⅰ类整合子,3．9％（2／51）检出Ⅱ类整合子,未检出Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子共检出5种类型的基因盒,分剐是sat基因盒（100％）,dfrAl＋aadAl基因盒（45．4％,20／44）,dfrAl7＋aadA5基因盒（22．5％,9／44）,dfrAl＋sat＋aadA2基因盒（6．8％,3／44）和4800bp未知基因盒（27．3％,12／44）,其中4800bp未知基因盒的下游携带有ESBLCTX-M基因,Ⅱ类整合子的基因盒携带dfrAl＋sat＋aadAl3种基因。 相似文献
20.
【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。 相似文献