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1.
猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：1
根据GenBank中猪2型圆环病毒（PCV2）的核酸序列，设计了1对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析，结果表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92．0％～93．3％，推导氨基酸序列的同源性为82．9％～84．6％。重组质粒pMD18-T-ORF2经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES。成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。 相似文献
2.
猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)0RF1基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(942 bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒,命名为pMD-ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢC,得到重组子,命名为pBAD／gⅢ-ORF1。测序分析表明克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性高达99.5％。与其它PCV2核苷酸序列同源性为92.1％-99.9％,推导的氨基酸序列同源性为90.2％-99.5％。同时,测序结果表明所克隆的ORF1准确插入pBAD／gⅢC的多克隆位点,未改变读码框架。用L-Arabi-nose进行诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE和Western blotting分析,显示PCV2 ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为4.1万。 相似文献
3.
猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：4，他引：1
参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。 相似文献
4.
猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达 总被引：3，自引：1，他引：3
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。 相似文献
5.
根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。 相似文献
6.
根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamH I和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamH I单酶切、BamH I和Sal I双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。 相似文献
8.
PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列，分别设计一对引物，应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段，进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定，同时对插入序列进行测序分析，表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％，pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建，为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
9.
猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。 相似文献
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猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。 相似文献
11.
本研究对367份猪内脏样本进行PCV2检测,对阳性样本进行2a/2b鉴别诊断,并采用ORF2测序方法对部分阳性样本进行测序。在发病猪群中PCV2b阳性率远高于健康猪群,而健康猪群中PCV2a的阳性率高于发病猪群,从而在临床表型方面论证了PCV2b毒力强于PCV2a。通过比较12株PCV2 ORF2推导氨基酸序列的关键氨基酸位点,9株PCV2b毒株在ORF2氨基酸76位为I,131位为T;而3株PCV2a毒株在ORF2氨基酸76位为L,131位为P,据比对结果可知,PCV2b毒株为强毒株,PCV2a毒株为弱毒株。研究结果表明,PCV2的2种亚型2a/2b无论是临床表型还是ORF2基因型,毒力表现都是有差异的,且PCV2b毒力要强于PCV2a。 相似文献
12.
研究了H2O2与Fe2+等金属离子产生的自由基胁迫对桑树生理特性的影响,旨在为桑树的抗逆栽培提供理论参考。以桑树叶片为材料,研究H2O2与Fe2+、Cu2+、Zn2+协同作用对桑自由基伤害和保护酶活性的影响。结果表明:经H2O2-Fe2+、H2O2-Cu2+和H2O2-Zn2+3种体系溶液处理的桑.OH含量分别提高34.38%、8.14%和5.43%;O2.-含量分别降低78.77%、54.75%和63.84%;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)清除率分别降低44.60%、57.34%和54.64%;超氧化物歧化酶(SOD)活性分别提高44.45%、36.02%和28.28%;多酚氧化酶(PPO)活性分别降低68.18%、86.58%和54.78%;过氧化氢酶(CAT)活性分别降低97.46%、96.57%和68.02%;过氧化物酶(POD)活性分别降低22.22%、提高7.42倍和66.67%。H2O2与Fe2+等的协同作用破坏了桑细胞内自由基动态平衡,导致自由基含量提高,保护酶活性受到显著影响。 相似文献
13.
旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。 相似文献
14.
对所分离鉴定的猪圆环病毒2型(PCV-2)ZZ株,参照GenBank中PCV-2全基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR扩增出PCV-2ORF2片段,原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET-ORF2,IPTG进行诱导表述,并进行Western blot分析。结果表明,PCR扩增产物长度为702bp,大小与预期的一致,成功构建重组质粒,经IPTG诱导成功获得分子质量约为30ku的表达蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性,为进一步研制PCV-2疫苗提供依据。 相似文献
15.
将猪IL2基因和PPV VP2基因、PCV2 ORF2截短基因克隆至真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2,用脂质体介导法将pCI-ORF2-VP2质粒转染PK15细胞,采用间接免疫荧光法检测在体外的表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCI-IL2和pCI-ORF2-VP2质粒联合肌注免疫小鼠,相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立pCI-ORF2-VP2、pCI空载体、猪细小灭活苗、圆环亚单位苗对照,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体的滴度。结果显示,pCI-ORF2-VP2在PK15细胞中能正常表达,联合免疫组在第28天能够检测到PPV和PCV2抗体,第21~42天诱导淋巴细胞转化和CD4+、CD8+细胞的数量高于或显著高于pCI-ORF2-VP2质粒组。结果表明,猪IL2质粒联合肌注可以提高VP2/ORF2核酸疫苗的免疫效果。 相似文献
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根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。 相似文献
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抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：7，自引：2，他引：7
利用本室构建的质粒PGEX-ORF2特化BL21（DE3）．经IPTG诱导表达．得到PCV2-ORF2的重组蛋白，经复性纯化后作为免疫原．采取常规免疫与体外脾脏免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／0的骨髓瘤细胞融合．经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，获得了2株抗PCV2-ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞．分别命名为382F4和9C3132，其细胞培养上清效价分别为1：1024、1：512，小鼠暖水效价分别为1：204800、1：102400。ELISA结果显示，382F4和9C3D2仅与融合表达的PCV2-ORF2蛋白反应，而与PGEX-KG表达的蛋白、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不反应．说明此2株单抗特异性好。间接免疫荧光结果显示．382F4和9C3D2能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应．表明所获得的2株单抗是PCV2型特异性的。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能．及建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了强有力的手段。 相似文献
19.
为分析牛乳头状瘤病毒2型贵州株(BPV2-GZ01株)L2基因的分子特征,预测编码蛋白的生物学功能。本试验对BPV2-GZ01株L2基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学相关软件及方法,对BPV2-GZ01株L2基因进行序列分析并对其编码蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,L2基因PCR扩增产物大小为1 404 bp,编码467个氨基酸;与参考株BPV2株、BPV2-AKS01株、BPV2-AKS01株、BPV13株、BPV1株相应序列核苷酸同源性分别为99.0%、99.7%、99.3%、83.9%和75.1%,氨基酸的同源性分别为98.9%、99.6%、99.4%、89.5%和82.7%;系统进化显示,BPV2-GZ01株L2基因与BPV2-SW01株亲缘关系最近;二级结构以无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋区域所占比例较大,预测此蛋白可能存在B细胞优势抗原表位,无跨膜区域,无信号肽区域。本研究结果将为贵州省BPV核酸疫苗研究提供理论依据。 相似文献
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猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近. 相似文献