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猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达 总被引：3，自引：1，他引：3
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。 相似文献
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猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：1
根据GenBank中猪2型圆环病毒（PCV2）的核酸序列，设计了1对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析，结果表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92．0％～93．3％，推导氨基酸序列的同源性为82．9％～84．6％。重组质粒pMD18-T-ORF2经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES。成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。 相似文献
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为构建猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5双基因共表达重组腺病毒,将扩增的ORF2基因和GP5基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.然后用Pme Ⅰ酶切穿梭质粒,使其线性化,将线性化质粒转化pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有ORF2和GP5基因,Western blot检测结果表明ORF2基因和GP5基因在293A细胞内获得表达.重组腺病毒经293A细胞连续传30代,TCID50稳定为10-9.0/mL.初步动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒能够刺激机体分别产生PCV-2和PRRSV的特异性抗体免疫应答反应.该重组腺病毒可以作为PCV-2与PRRSV二联基因工程疫苗研究的候选毒株. 相似文献
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为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因和猪圆环病毒2(PCV2)ORF2双基因共表达重组腺病毒.将扩增的PRRSV GP5基因和PCV2 ORF2基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293 A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有GP5和ORF2基因,western blot检测结果表明GP5基因和ORF2基因在293 A细胞内获得表达. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。 相似文献
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两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间. 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因,将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )载体上,获得重组质粒,经PCR酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为ORF2目的基因,插入的位置、大小和阅码框均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后,以每只小鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况,同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明,pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在,产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7天开始产生抗体,第28天抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了猪圆环病毒的特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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为了进一步研究PRRSV新型疫苗,为有效控制PRRSV,试验采用RT-PCR的方法扩增出PRRSV M蛋白基因片段ORF6,将该基因克隆到pMD18-T载体,并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行分析.在此基础上以pIRES-neo为载体,构建含有ORF6基因的重组核酸疫苗质粒pIRES-ORF6.结果表明:该... 相似文献
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为解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)删除外源基因的机制,以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,构建在PRRSV全长基因组上同时包含其Nsp2区域缺失108nt及其ORF1与ORF2间插入猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2的全长cDNA pDCPV,将pDCPV转染Marc-145细胞,获得拯救病毒vDCPV。鉴定vDCPV的遗传稳定性发现,vDCPV比先前发表的只在PRRSV ORF1与ORF2间插入PCV-2ORF2获得的拯救病毒vCPV更具有遗传稳定性,这提示PRRSV删除外源序列的最主要机制是插入外源序列后导致基因组过长,由此可能影响N蛋白与基因组作用及其他结构蛋白包装过程。IFA结果显示,vDCPVP能微弱表达PCV-2cap蛋白。 相似文献
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PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。 相似文献
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分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。 相似文献
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根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。 相似文献
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为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息,从锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ株)获得ORF124基因,应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF124基因结构和功能,并与Genbank上已公布的三株KHV进行比较分析.结果显示,ORF124基因的理论分子质量为31221.96 Da,KHV-CJ株与其他三株KHV同源性均为99％;信号肽切割部位最可能位于24位的T(苏氨酸)和25位的V(缬氨酸)氨基酸之间;ORF124基因无跨膜区;氨基酸序列不存在潜在的N-糖基化位点、11个潜在的O-糖基化位点和7个磷酸化位点.该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高,预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因. 相似文献
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以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到579 bp的猪圆环病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a重组,通过菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的产物,Western blot验证其免疫原性,重组蛋白免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体内中和抗体滴度。获得的重组蛋白包涵体的形式出现,表达量占菌体总蛋白的30%,变性纯化后纯度达90%以上,Western blot证实重组蛋白能与PCV-2阳性血清发生反应,免疫Balb/c小鼠45 d后中和抗体滴度达到1∶22。 相似文献
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猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近. 相似文献
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本试验旨在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在抗体免疫选择压力下分子变异情况进行研究。将HPPRRSV-JXA1株在添加适量抗体或不添加抗体的Marc-145细胞上连续传代各30代,获得毒株JXA1-Abf30和JXA1-f30。对传代前后毒株的ORF3和ORF5基因进行扩增、克隆和序列分析,研究结果显示,JXA1-Abf30和JXA1-f30在ORF3和ORF5基因上核苷酸发生突变位点数累计分别为18和9个,氨基酸发生突变位点数累计分别为15和3个。JXA1-Abf30和JXA1-f30的核苷酸突变速率比为186%,氨基酸突变速率比为500%,非同义突变(NS)与同义突变(S)比值(NS/S)分别为5.0和0.5。此外,抗体压力下传代的毒株ORF5基因有4个碱基位点发生稳定的非同义突变,其中2个(AA31和AA190)与已知抗原表位有关。由研究结果可知,抗体压力下传代的PRRSV的突变速率和非同义突变数目明显高于无抗体压力下的传代毒株;抗体免疫选择压能显著影响PRRSV的ORF5基因变异,并呈现明显的压力选择性突变,对ORF3基因变异的影响小于ORF5基因。 相似文献
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2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。 相似文献