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1.
为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制,筛选免疫防御相关功能基因,以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库;以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率;对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果显示,该文库的差减效率可达210倍;PCR阳性检测显示差减片段为100~750 bp,对随机挑取600个克隆的测序结果显示,共获得414个有效EST序列;通过BLAST同源性比对,有167个EST序列(占40.34%)与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性,其中7个EST序列(占1.69%)与免疫防御相关基因同源;此外,204个EST(占49.28%)在数据库中未发现同源序列。研究表明,SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因,研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础。 相似文献
2.
文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。 相似文献
3.
B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma, Bcl-2)基因作为一种重要的细胞凋亡调控基因,在内源性细胞凋亡通路中发挥着重要的调控作用。实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmBcl-2-like基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析了PmBcl-2-like在马氏珠母贝不同组织、不同发育时期以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmBcl-2-like cDNA全长为2 180 bp,开放阅读框长度为1 650 bp,共编码549个氨基酸,分子量为21.62 ku;结构域预测分析表明PmBcl-2-like含有Bcl-2家族典型的BH1-4结构域;多序列比对以及进化树构建结果表明,PmBcl-2-like与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明PmBcl-2-like在马氏珠母贝8个组织中均有表达,在鳃中表达量最高,其次为性腺,表达量最低为中央膜区;在胚胎期表达量较高,受精卵时期表达量最高。机体受到脂多糖(LPS)刺激后,相对表达量在24 h达到最高,72 h降到最低,最高约为最低的2.5倍;肽聚糖(PGN)刺激后,相对表达量在6 h达到最高,48 h降到最低,最高约为最低的7.28倍;聚肌胞苷酸(Poly:IC)刺激后,相对表达量在3 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的6.49倍。研究表明,PmBcl-2-like可能在马氏珠母贝发育和免疫防御反应中担任着重要的角色。 相似文献
4.
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化级联将细胞外信号传递给细胞。本研究利用cDNA 末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmMAKP p38基因cDNA 全长序列并对其序列进行生物信息学分析；利用实时荧光定量 PCR（qPCR）技术分析了PmMAKP p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示PmMAKP p38 cDNA全长为1516 bp，开放阅读框长度为1071 bp，共编码356个氨基酸，分子量为 40.88 kDa；结构域预测分析表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域；多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高；荧光定量分析结果表明该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达，在肝胰腺中表达量最高，其次为外套膜，最低是闭壳肌。机体在受到LPS刺激后，相对表达量在2 h达到最高，12 h降到最低，最高约为最低的5倍；哈维氏弧菌刺激后，相对表达量在2 h达到最高，8 h降到最低，最高约为最低的4倍。研究表明，PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应中起着重要的作用。 相似文献
5.
果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是催化糖异生过程中的限速酶,当动植物处于温度胁迫等不良环境条件时,FBP通过参与糖异生途径以维持机体的糖平衡,在动植物抗逆过程中起着重要作用。本研究通过RACE技术获得了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii) FBP(Pm-FBP)基因c DNA全长,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝不同组织中的表达量,以及在17℃(低温组)、22℃(对照组)、32℃(高温组)条件下鳃中的时序表达模式。序列分析显示,Pm-FBP全长为1381 bp,具有54 bp的5￠UTR和62 bp的3￠UTR,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,预测分子量为37.13 kDa,等电点为6.02。Pm-FBP具有一个Pfam FBPase保守结构域,6个潜在的O-连接糖基化位点(Ser36、Ser56、Ser57、Ser76、Ser80和Thr115),1个潜在的N-糖基化位点,1个金属结合位点(Asp-Pro-Ile/Leu-Asp-Gly/Ser-Thr/Ser)和46个磷酸化位点。多序列比对结果显示,Pm-FBP与长牡蛎(Crassostrea gigas)FBP的相似性最高,为83%;系统进化树显示,Pm-FBP与长牡蛎等贝类聚为一支,然后再与其他软体动物聚为一大支,节肢动物和脊椎动物分别聚类,进化树总体聚为三大支。实时荧光定量结果显示,Pm-FBP在所检测的闭壳肌、鳃、性腺、肝胰腺、足和外套膜等组织中均有表达,在性腺表达量最高,肝胰腺和鳃中有较高表达;对Pm-FBP时序表达的分析发现,Pm-FBP在低温组和高温组实验时间范围内均出现先上升后下降的趋势,且在72 h时达到最大值,表明Pm-FBP参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;在120h时,高温组和低温组的Pm-FBP表达量均显著下降,表明Pm-FBP可能主要在短期的温度胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探索马氏珠母贝对温度胁迫的适应性提供了参考资料。 相似文献
6.
利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤Clq基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316 bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸.在文蛤Clq(MmClq)蛋白中,Clq结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域均具有较高的同源性.通过荧光实时定量PCR,MmClq mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高.在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,Clq相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmClqmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍.包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性. 相似文献
7.
Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。 相似文献
8.
含 C1q 结构域蛋白(C1q domain containing, C1qDC)是经典补体途径的起始分子, 能够识别免疫复合物, 启动补体系统经典途径。本研究基于马氏珠母贝(Pinctada fucata)全基因组测序数据, 结合生物信息学方法对 C1qDC 基因进行了鉴定, 同时对其系统进化关系、序列结构、基序组成、染色体定位和基因家族成员的表达水平进行了分析。结果显示, 从马氏珠母贝全基因组数据中共鉴定出 285 个 C1qDC 基因; 根据系统进化关系聚集为 5 个亚类, 不均匀分布在 14 条染色体上; 所有 C1qDC 序列均含有保守基序 1。比较转录组数据分析显示, 在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)攻毒 4 h 后, 马氏珠母贝 C1qDC 基因家族中有 56 个基因在血细胞中的表达水平发生了显著变化。其中, 上调表达基因 32 个, 下调表达基因 24 个。实时荧光定量 PCR 检测结果表明, 随机挑选的 8 个 C1qDC 基因的表达模式与转录组数据一致。本研究结果为进一步解析马氏珠母贝 C1qDC 基因的进化模式及其在贝类免疫应答中的调控作用提供了理论基础。 相似文献
9.
为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。 相似文献
10.
利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆团头鲂Megalobrama amblycephala铁蛋白基因c DNA全长序列;同时研究经嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒后团头鲂肝组织中铁蛋白表达的变化,了解铁蛋白基因在团头鲂免疫应答中的作用。结果表明:团头鲂铁蛋白c DNA全长序列包括150bp的5’末端序列(untranslated region,UTR),270bp的3’UTR,以及522bp编码174个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)。这些氨基酸序列同其他鱼类铁蛋白M链氨基酸序列同源性较高。团头鲂铁蛋白基因在5’非编码区核甘酸序列124~154的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。荧光定量PCR分析表明:铁蛋白基因在团头鲂肌肉、心脏、鳃、肝胰脏、脑和肾脏等组织器官中都有表达,在肝胰脏的表达量最高,脑组织表达量最低。经嗜水气单胞菌急性感染后,团头鲂肝胰脏组织中铁蛋白基因表达量显著上调。上述结果表明:团头鲂铁蛋白M亚基在团头鲂免疫应答过程中起重要作用。 相似文献
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为揭示大头鳕TNFSF6基因的基本结构与功能及其在大头鳕发育和神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus, PCNNV)暴发时的响应机制,本研究通过基因克隆获得TNFSF6 cDNA开放阅读框序列,并对序列进行生物信息学分析,运用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对TNFSF6在不同组织、孵化后不同日龄仔鱼和PCNNV感染前后仔稚鱼中的表达水平进行检测。结果显示,大头鳕TNFSF6 cDNA长1 388 bp,5′UTR占315bp,3′UTR占500 bp,ORF全长573 bp,编码190个氨基酸。qRT-PCR结果显示,TNFSF6在各组织均有表达,但在脾脏和鳃组织中的表达量较高;大头鳕孵化后15、20、37和40 d TNFSF6基因的转录水平分别是其在5 d转录水平的0.28、0.15、0.12和0.13倍。在24 d和46 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6基因的转录水平高于对照组;在77 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6转录水平则显著低于对照组。研究表明,TNFSF6基因在大头鳕发育早期和仔鱼暴发PCNNV时发挥了重要的作用。 相似文献
12.
为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,M n S A A基因c D N A全长649 b p(G e n B a n k登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12~72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12~72 h和6~72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。 相似文献
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C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。 相似文献
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为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。 相似文献
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为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。 相似文献
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为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。 相似文献
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为研究Akt基因在中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Akt(命名为Es Akt)的全长为2 200 bp的c DNA序列,包括159 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、496 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和长度为1545 bp编码514个氨基酸的编码序列。蛋白质结构域分析显示Es Akt含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域。多序列比对和系统发育分析显示,Es Akt与中国明对虾、凡纳滨对虾的Akt序列一致性都为0.889,在系统发育树中节肢动物Akt形成一个分支。应用荧光定量RTPCR技术分析Es Akt在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Akt在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中卵巢、眼柄和精巢中表达量较高,肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期不同部位的肌肉中,Es Akt表达量变化不同,步行足肌肉组织中Es Akt m RNA无显著的统计学差异。腹部肌肉组织中Es Akt m RNA水平在蜕壳前晚期D3~D4期表达量显著高于蜕壳后A~B期和蜕皮间期C期。螯足肌肉在蜕壳前晚期D3~D4期急剧下调,蜕壳后A~B期开始表达量显著升高,直至蜕皮间期C期。研究表明,Es Akt在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量变化与蜕壳周期密切相关,说明Es Akt参与中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。 相似文献
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中国明对虾在养殖中表现出较强的竞争行为,对其生长性能产生了较大的影响,然而,到目前为止其发生的分子机制尚不清楚。钙调神经磷酸酶(calcineurin,CN)是高度保守的Ca2+/钙调蛋白(calmodulin,CaM)依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,由催化亚基(CNA)和调节亚基(CN-B)组成,是参与许多重要生理过程的多功能蛋白质。CNB在Ca2+/CaM的介导下主要在动物的中枢神经系统发挥重要作用。另外,前期通过比较转录组分析筛选出的与中国明对虾竞争行为相关的候选基因中包括CNB基因。为了进一步明确CNB在中国明对虾竞争过程中的作用,实验通过RACE技术克隆了中国明对虾CNB基因(FcCN-B)的全长cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析了其在高竞争能力组(HCG)和低竞争能力组(LCG)组间不同组织(神经节、心脏、胃、肝胰腺和肠)中的表达情况。结果显示,FcCN-B的cDNA全长序列为2867 bp,包括95 bp的5′非编码区(UTR),540 bp的开放阅读框(ORF),和2232 bp的3′UTR,其中ORF中具有4个保守的EF-hand Ca2+结合结构域。蛋白质同源性分析显示,FcCN-B的氨基酸序列与其他物种具有较高的同源性(78.8%~93.8%),其中最高的是中华绒螯蟹(93.8%)和黑腹果蝇(90.5%);系统进化关系分析显示,脊椎动物和无脊椎动物分别独立为一支,且中国明对虾与中华绒螯蟹单独聚为一支,之后与黑腹果蝇聚类关系最近,提示FcCN-B在中国明对虾中可能具有与其在中华绒螯蟹和果蝇中相类似的功能。Real-time PCR定量结果显示,FcCN-B在HCG组的神经节中的表达极显著高于LCG组,而其在HCG组的心脏中的表达极显著低于LCG组。研究结果表明,calcineurin B基因在中国明对虾的竞争行为中可能发挥一定的作用,将为解析中国明对虾竞争行为的分子机制奠定重要的基础。 相似文献
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为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽序列,成熟蛋白中含有8个半胱氨酸残基。系统进化树分析显示不同物种的相同IL-17亚型聚为一支,香鱼IL-17C与其他脊椎动物IL-17C聚为一支;同源比对结果显示香鱼IL-17C与虹鳟的IL-17C1和IL-17C2亲缘关系最近,相似性分别为40.72%和33.51%。q RT-PCR检测显示IL-17C基因在健康香鱼的心、肝、脾、头肾、鳃、脑、肌肉和肠等组织中均有表达,鳃和头肾中表达量较高。经鳗利斯顿氏菌侵染后,香鱼肝脏中IL-17C基因表达变化最大,菌侵染8 h时的表达量为对照组的9.17倍;其次为脾,菌侵染4 h时的表达量为对照组的6.69倍。研究表明,香鱼IL-17C基因的表达与病原菌侵染密切相关,可能在免疫功能中具有重要作用。 相似文献
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为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。 相似文献