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1.
试验旨在对羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因进行克隆、原核表达及纯化,并对表达蛋白toxA-N进行生物信息学分析,为探索羊源多杀性巴氏杆菌毒素基因的相关特性提供参考依据。以羊源多杀性巴氏杆菌基因组为模板,参考GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌HN06中toxA基因序列（登录号：CP003313.1）设计引物,通过PCR技术扩增出目的片段,构建重组质粒pET28a （+）-toxA-N,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达后,经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定,纯化蛋白并运用生物信息学软件对表达蛋白进行特性分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 515 bp的toxA-N基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到大小约为5 369和1 515 bp两条片段,表明成功构建了pET28a （+）-toxA-N重组质粒,IPTG诱导表达的菌株经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定后,成功表达出大小约为60 ku的toxA-N蛋白;生物信息学分析表明,toxA-N蛋白为包涵体,其分子式为C2635H4002N664O797S17,原子总个数为8 115,消光系数为84 480,不稳定指数为43.50,亲水性平均值为-0.381。在toxA-N蛋白二级结构中,α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占53.47%、2.77%、11.28%和32.48%,与三级结构预测结果一致。本试验通过对toxA-N基因的初步研究,揭示了多杀性巴氏杆菌毒素的相关特性,对家畜的疾病预防、诊断、治疗具有重要意义。 相似文献
2.
本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C_(1684)H_(2619)N_(457)O_(505)S_3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
3.
本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
4.
羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a(+)载体相连,构建pET-28a(+)-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645bp的目的片段,并表达出大小约28ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07(GenBank登录号:CP007040.1)和Pm70(GenBank登录号:AE004439.1)株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87(40),在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30h,疏水指数为82.15,总平均疏水性(GRAVY)为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。 相似文献
5.
为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。 相似文献
6.
试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。 相似文献
7.
《中国兽医杂志》2014,(6)
本试验旨在克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OMPH1基因,并对其表达产物的反应原性进行研究。以兔多杀性巴氏杆菌C51-2-499株总DNA为模板,进行外膜蛋白基因OMPH1的PCR扩增,得到了1条大小为1 041 bp的基因片段,克隆至pMD-18T中。测序分析证明,它与国内外报道的多杀性巴氏杆菌OMPH1基因的核苷酸序列相似性达99%以上。将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,经酶切和测序分析表明,重组表达载体pET-30a(+)-OMPH1构建成功。将此重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE检测结果证实,该基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到表达,表达产物的分子质量约47KD,与预期的结果一致。Western-blot分析表明,OMPH1重组表达蛋白具有反应原性,可被兔多杀性巴士杆菌阳性血清识别,为兔多杀性巴氏杆菌基因重组疫苗及新型诊断试剂的研究奠定了基础。 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2019,(11)
为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原,本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原,将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化,经序列分析鉴定后,分别使用BamHⅠ、HindⅢ与BlpⅠ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1(Tox1)、片段2(Tox2)和片段3(Tox3)分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中,构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示,构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp,与GenBank中相关序列具有高度同源性;3个蛋白片段表达正常,表达量分别达到379.95、447.62与459.82μg/mL,SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku;因3个片段位置不同,仅Tox3有Western blotting检测条带,与理论预测相符;使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后,二免后14 d,血清经试剂盒检测阳性率达到100%,对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段,且具有较好的免疫原性。 相似文献
9.
为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原，本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原，将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化，经序列分析鉴定后，分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中，构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示，构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp，与GenBank中相关序列具有高度同源性；3个蛋白片段表达正常，表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL，SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku；因3个片段位置不同，仅Tox3有Western blotting检测条带，与理论预测相符；使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后，二免后14 d，血清经试剂盒检测阳性率达到100%，对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段，且具有较好的免疫原性。 相似文献
10.
《畜牧与兽医》2020,(5)
旨在克隆和表达羊源多杀性巴氏杆菌的ExbD基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。试验通过PCR成功扩增出目的基因片段,将所回收片段与pET-28a(+)载体进行连接,构建pET-28a(+)-ExbD重组质粒,将所得pET-28a(+)-ExbD重组质粒经双酶切鉴定后转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过自诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果显示:扩增出390 bp的目的基因,诱导表达得到约为19 ku的重组蛋白。经生物信息学分析,该蛋白为疏水性酸性蛋白,属于稳定蛋白,分子式为C_(656)H_(1068)N_(160)O_(193)S_3,分子质量约为14.44 ku,消光系数(L·mol~(-1)·cm~(-1)=280 nm)为6 990,理论等电点是5.16,不稳定系数为35.28(40),总平均疏水性(GRAVY)为0.145,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验通过对ExbD基因的克隆、表达和分析,为进一步探究该基因的功能提供了基础和参考依据。 相似文献
11.
利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCA(pcDNA3.1-OmpA),将该重组质粒体外转染Vero细胞,检测其转录和表达情况。结果表明重组质粒pCA构建成功,通过RT-PCR由转染了重组质粒的Vero细胞中扩增出了目的条带,间接免疫荧光试验分析表明在转染了pCA的Vero细胞中出现绿色荧光,Western blotting分析显示重组质粒pCA转染的Vero细胞泳道出现约37.5 ku的特异条带,说明ompa基因在Vero细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。 相似文献
12.
参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。 相似文献
13.
试验旨在克隆和表达羊源性类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallea)的BPSL1467基因,并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。以羊源类鼻疽伯克霍尔德菌(BPHN1株)基因组为模板,参照GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌K96243标准株BPSL1467基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因片段,将所得片段与pET-28a(+)载体连接,构建pET-28a(+)-BPSL1467重组质粒。将鉴定正确的pET-28a(+)-BPSL1467重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物。使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA和Protscale相关生物信息学软件对BPSL1467基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,本试验成功克隆了462bp的BPSL1467基因,诱导表达重组蛋白大小约为22ku,主要以包涵体的形式存在。BPSL1467蛋白分子式为C763H1209N203O217S6,分子质量为16 890.58u;其不稳定系数为33.95,属于稳定蛋白;理论等电点(pI)为8.85,为碱性蛋白;总平均疏水性(GRAVY)为-0.190,为亲水性蛋白。该蛋白的二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。本试验结果为深入研究羊源类鼻疽伯克霍尔德菌的BPSL1467基因的分子作用机理提供了参考依据。 相似文献
14.
《中国兽医学报》2016,(2):265-270
克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。 相似文献
15.
羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列(登录号:CP007040.1),使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物,选取高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段,并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增产物约为615bp,编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高,而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现,ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3,分子质量为21.90ku,理论等电点(pI)为9.16,属碱性蛋白质,疏水指数为96.57,总平均疏水性(GRAVY)为0.173(>0),属于疏水类蛋白;前21位氨基酸为信号肽,第5-27位氨基酸区域存在1个跨膜区,存在N-糖基化位点及磷酸化位点,不存在O-糖基化位点,具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位;二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%;三级结构是呈β-桶状的单聚体,隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。 相似文献
16.
羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。 相似文献
17.
试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C2735H4428N786O855S16,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。 相似文献
18.
本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。 相似文献
19.
产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。 相似文献
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猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达 总被引：7，自引：0，他引：7
利用已分离的菌株030224HB，根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物，用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH)，扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp)，并克隆到载体pMD18-T(T-Vector)，测序表明该基因相当保守。用pET-28b构建了原核表达载体pET28b-ompH，转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为35ku，与报道大小相近。Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性，然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。 相似文献