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为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。 相似文献
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根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。 相似文献
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猪链球菌通用型和2型双重荧光定量PCR快速检测技术的建立和应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为快速区分检测猪链球菌血清型2型和其他血清型,以猪链球菌的保守基因gdh和2型特异性基因cps2J为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立猪链球菌通用型和2型特异性的双重荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示:本方法在1.5h内可完成猪链球菌和2型猪链球菌同时检测,与其他细菌无交叉反应;检测灵敏度可达5拷贝数,标准曲线相关系数大于0.999,批内和批间CV均小于1.25%。对67份临床样品检测显示猪链球菌和2型猪链球菌检出率分别为79.1%和35.8%,与常规PCR检测结果的符合率为92.5%和89.6%,kappa值为0.800和0.757,具有极好的一致性。成功建立了灵敏、特异和稳定的双重荧光定量PCR方法,实现了猪链球菌和2型猪链球菌同时及快速诊断。 相似文献
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根据GenBank上公布的MRP与CPS2J的开放性阅读框保守序列,运用BEACON Desigener 2.0软件设计和合成了2对引物和其相应的荧光探针,优化各个反应物的浓度和实时荧光PCR循环程序,建立从组织中直接检测2型链球菌主要毒力因子MRP与CPS2J的实时荧光PCR方法.双重实时荧光PCR检测2型猪链球菌方法能够从病料中直接检测2型猪链球菌并可以检测出该菌的主要毒力基因MRP,运用该方法可以最低检测到24CFU/mL 2型猪链球菌,并且与其他血清型链球菌和其他病原菌无交叉反应.特异性良好.通过对8个样品在3个不同时间的检测.结果显示该方法的稳定性和重复性均很好. 相似文献
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猪链球菌2型LUX荧光PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
猪链球菌2型是一种严重的人兽共患病病原,为满足猪链球菌2型快速检测的需要,本研究根据猪链球菌2型Cps2J保守区设计LUX引物,首次利用LUX PCR方法对猪链球菌2型进行检测,并进行了敏感性和特异性试验及模拟样品检测试验。结果显示,本研究建立的猪链球菌LUX 荧光PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,检测质粒样品的敏感性为10拷贝,检测模拟样品敏感性为102拷贝,与无乳链球菌、巴氏杆菌、粪链球菌、马链球菌兽疫亚种、沙门氏菌等无交叉反应。该方法的建立为猪链球菌2型的快速检测提供了新的途径。 相似文献
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猪链球菌1、7、9型多重PCR诊断方法的建立及初步应用 总被引：3，自引：3，他引：0
为了建立猪链球菌（Streptococcus suis,SS）1、7、9型（SS1、SS7、SS9）的快速鉴别诊断和分型方法,本研究根据GenBank已登录的SS1型特异性的CPS1I基因、7型CPS7H基因、9型CPS9H基因设计引物,以标准SS1、SS7、SS9株基因组DNA为模板,建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的多重PCR检测方法对11份猪链球菌的临床分离纯化菌株进行了的应用检测。结果表明,成功建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100 CFU/mL,特异性和重复性好;利用多重PCR检测方法对11份猪链球菌临床分离纯化菌株检测结果表明,11份样品中有3份样品为SS9阳性、2份样品为SS7阳性、1份样品为SS1阳性。本研究为临床上SS1、SS7、SS9的快速鉴别诊断提供了一种新方法。 相似文献
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为快速诊断和检测猪链球菌病,根据GenBank中已登录的猪链球菌抗原基因保守区域序列,设计并合成特异性引物及Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应体系及扩增条件,构建了快速、准确检测猪链球菌的Taqman荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR),测定了该方法的灵敏性、重复性和特异性,并对疑似猪链球菌临床感染样本进行了检测。结果显示:所建立的Taqman FQ-PCR方法检测灵敏度为1×10~2拷贝/μL;对3种不同浓度的猪链球菌重组质粒进行3次重复扩增,变异系数均小于3%,说明重复性好;特异性检测显示,只有猪链球菌样本的扩增曲线呈阳性反应,其他致病菌均无荧光信号;采用此方法,对30份临床疑似猪链球菌感染样本进行检测,发现有27份样本为阳性,比采用国标法检测得到的结果更加灵敏。结果表明,建立的FQPCR方法具有灵敏性高、重复性好、特异性强等特点,可用于猪链球菌的快速诊断和检测。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R~2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。 相似文献
10.
根据GenBank公布的副鸡禽杆菌hagA基因序列设计特异性引物,经PCR扩增出了123bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R2=0.999 8;溶解曲线特异,产物Tm在81.3~81.5℃之间;最低检测限为0.18拷贝/μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;该方法不与其细菌发生交叉反应,呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于1%,说明该方法重复性很好;临床副鸡禽杆菌样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR方法的检测率明显高于常规PCR方法,为该病的早期快速诊断,并定量分析副鸡禽杆菌感染程度奠定了基础。 相似文献
11.
LI Jian-da YU Jiang ZHANG Yu-yu REN Su-fang CHEN Lei GUO Li-hui SUN Wen-bo CHEN Zhi WANG Song LIU Jun-zhen DU Yi-jun LI Jun YANG Ling-zhi WANG Jin-bao WU Jia-qiang 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3107-3113
In this study,a quantitative Real-time PCR method using the specific primers according to CPS2J gene was established to detect Streptococcus suis serotype 2. The result showed that the equation of standard curve was y=-3.073x+36.87,r=0.995,which demonstrated that the assay had good linear relationship.The melting curve analysis showed that there was only specific peak.Sensitivity test showed that the method could detect the template at the lowest concentration of 1.0×101 copies/μL,which was 10 times higher than the ordinary PCR.The specific tests showed that this method could able to detect Streptococcus suis serotype 2 specially and had no cross-reaction with other serotypes or other bacteria from swine. The CV of repeatability test was 0.37% to 0.63%,lower than 2.5%. The clinical diagnosis showed this assay was more sensitive than ordinary PCR and bacteria isolation. All the results showed that the established method was sensitive,specific and reproducible,which could be used for the rapid diagnosis and quantitative detection of Streptococcus suis serotype 2. 相似文献
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为验证猪链球菌2型荧光PCR检测方法对临床样品检测的敏感性和适用性以及该方法所拥有的独特优点,分别用荧光PCR法、常规PCR法和细菌分离法对人工感染猪链球菌2型的小鼠肝脏和发病猪的心、肝、脾、肾等实质器官和血液、喉拭子进行抗原检测。结果显示,荧光PCR法检出率为70.8%,明显高于普通PCR法（检出率为20.8%）,也高于常规细菌分离法（检出率为45.8%）。由于临床样品常常会被其他细菌污染,细菌分离法很难准确分离到链球菌。但荧光PCR法不受其他细菌污染的影响,对实验室培养的猪链球菌2型菌液,该方法检测滴度可达10-6/0.1mL（42～52 CFU/0.1 mL）,而普通PCR方法检测滴度仅为10-4。 相似文献
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检测猪链球菌２型的溶菌酶释放蛋白（ＭＲＰ）的ＰＣＲ方法的建立 总被引：15，自引：1，他引：14
根据猪链球菌２型的mrp基因自设计和合成了一对可扩增长度为８８５bp目的片段的引物，成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白（ＭＰＲ）的ＰＣＲ方法，用ＸbaⅠ内切酶进行酶切，获得了与预期一致的５７8bp和３０７bp２的２个片段，并进行了ＰＣＲ的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的ＰＣＲ检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１００个细菌。另外，对９株从病猪体内分离的猪链球菌２型菌株进行检测了８个呈阳性；对１５份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是１份为阳性。结果表明此法特异性敏感性均很高，可作为ＭＲＰ快速诊和流行病学调查的手段。 相似文献
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多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用 总被引：6，自引：1，他引：6
建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。 相似文献
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根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。 相似文献
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猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。 相似文献
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为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献