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1.
试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
2.
为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
3.
《畜牧与兽医》2016,(5):31-38
为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)血清抗体的间接ELISA方法,将TGEV的N基因片段克隆到p ET-28a载体中,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并对表达的蛋白进行Western-blot鉴定。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,最终建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法。该ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等5种病毒阳性血清不发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。本研究可为猪传染性胃肠炎的流行病学调查、诊断与防控奠定基础。 相似文献
4.
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）核蛋白（NP）基因是高度保守序列．其编码的NP是病毒粒子的主要组成成分。N基因在PCR分离后，亚克隆到PQE30载体上的组氨酸亲合标志的N端，产生与组氨酸融合的重组融合N蛋白，经Ni-NTA金属亲合层析纯化后免疫家兔，产生了多克隆抗体，此抗体与相应的抗原反应所产生的特异性条带和此抗原与抗NP单克隆抗体反应所产生的特异性条带一致。证明重组融合N蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 相似文献
5.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为快速检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体,本研究以原核表达系统串联表达的含有TGEV S蛋白抗原表位C的重组蛋白r-(C_1C_2)6为包被抗原建立TGEV血清抗体的Dot-ELISA检测方法。经反应条件优化结果显示,抗原最适包被量为62.5 ng/点;血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶80和45 min;羊抗猪IgG-HRP最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min;最适封闭条件分别为5%脱脂乳37℃,45 min;血清和酶标抗体最适反应温度均为37℃;最佳显色时间7.5 min。结果显示该方法与猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。该方法对TGEV阳性血清最低检测限为1∶1 280。采用建立的Dot-ELISA对27份临床猪血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA与TGEV/PRCV抗体检测试剂盒检测结果的符合率为92.6%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异,适合用于TGE快速诊断。 相似文献
6.
为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。 相似文献
7.
猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测. 相似文献
8.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2020,(6)
利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。 相似文献
10.
抗猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及其部分特性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法进行细胞克隆,经过3次克隆筛选,最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(命名为E10F10D5),其染色体平均记数为87±10对,间接ELISA检测制备的腹水效价达1:12 800,以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Westernblot分析,该腹水识别病毒结构蛋白质分子量约43ku,即TGEV天然N蛋白. 相似文献
11.
猪传染性胃肠炎免疫胶体金诊断试剂条的研制 总被引：1，自引：0，他引：1
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,用TGEV单克隆抗体标记,并包被在玻璃纤维膜上.另外将纯化的TGEV单克隆抗体和羊抗小鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成TGEV快速检测条,对其灵敏性、特异性、稳定性及保存期检测.结果表明,研制的TGEV快速检测条检出TGEV最低量为150 μg/mL,只能检测出TGEV,而与猪瘟病毒培养液、猪繁殖障碍与呼吸综合症（PRRS）、鸡减蛋综合症（EDS-76）病毒、鸽新城疫（PPMV-1-PL）病毒、大肠杆菌及沙门氏菌无交叉反应;研制的三批试验条性能稳定,保存期试验证实该条在常温下可保存1年.试验证实所研制的试剂条具有灵敏特异稳定无交叉反应,可用于生产实际. 相似文献
12.
本研究根据Genbank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和S基因保守区序列设计合成了两对引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测TGEV的方法。该方法能有效地鉴别序列密切相关的猪传染性胃肠炎病毒与呼吸道冠状病毒。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3个小时以内,具有很好的特异性和重复性。通过对39份临床样品进行检测,结果表明所建立的检测方法直接检测样品中猪传染性胃肠炎病毒。 相似文献
13.
柱状黄杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
The aim of this study was to develop a rapid method for the detection of Flavobacterium columnaris based on a double antibody sandwich ELISA （DAS-ELISA）. Purified monoclonal antibody against Flavobacterium columnaris was used as the capture antibody, while polyclonal antibody was used as the detection antibody. The optimal conditions for the ELISA were as follows: monoclonal antibody with 0.08 μg per well was added to coat overnight at 4 ℃; the plate was blocked by 30 g/L bovin serum albumin for 90 min at 37 ℃; incubation concentration of polyclonal antibody was 0.11 μg per well; the incubation time for detection antigen, polyclonal antibody and enzyme labeled antibody was 1 h at 37 ℃ for each; the value of D492 nm was obtained after 15 min coloration. Judging with P/N≥2.1 and D492 nm≥0.776 as positive criteria. This method had no cross reaction with Edwardsiella tarda, E. coli, Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio harveyi. Its minimum detectable limit was 1×103 CFU. Therefore, this study provided a specific and sensitive detection method for Flavobacterium columnaris for the first time. 相似文献
14.
利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37 ℃封闭2 h;血清最适稀释度为1∶100,37 ℃作用2 h;兔抗猪IgG/辣根酶（HRP）（1∶3000）,37 ℃作用2 h;37 ℃避光显色15 min读取D450 nm值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D450 nm值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D450 nm值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。 相似文献
15.
利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测. 相似文献
16.
为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA （iELISA）诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白（rCPR）进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8 μg/孔,血清最佳稀释度为1：50,酶标二抗最佳稀释度为1：5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3% BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D450 nm值>0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均<10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。 相似文献
17.
以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。 相似文献
18.
为确定猪支原体在临床的感染情况和进行血清流行病学调查,本研究以原核表达纯化的猪支原体MSG1重组蛋白为包被抗原,建立了检测猪支原体的间接ELISA诊断方法。通过对ELISA反应一系列条件的优化,确定了最佳抗原包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭条件为用1%BSA37℃温箱内封闭2 h;血清最适稀释度为1∶200,作用时间为1.5 h;酶标二抗最适稀释度为1∶15 000,最适作用时间为1 h;最后37℃显色15 m in。判定标准为OD450≥0.239时判为阳性,OD450<0.198时判为阴性,0.198≤OD450<0.239时判为可疑。敏感性、特异性和可重复性试验证明,该检测方法敏感性高、特异性强和可重复性好。该研究表明建立的间接ELISA方法为猪支原体的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。 相似文献
19.
据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因的保守区序列设计合成了引物和探针,对荧光定量RT-PCR的反应条件进行了优化,建立了一种特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量RT-PCR方法来检测TGEV。与国外进口的An imal Genetics公司生产TGEV抗原快速检测试剂盒进行比较,符合率达到100%;与常规RT-PCR检测方法相比,灵敏度高100倍。用该方法对辽宁、山东、福建等地的送检疑似病料进行了检测,结果阳性率为24%。试验证明,所建立方法适用于猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断、流行病学调查等相关研究。 相似文献
20.
REV重组env蛋白间接ELISA诊断试剂盒的研制 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的env蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA（ienv-ELISA）方法。ienv-ELISA工作条件优化结果表明,最佳包被液为CB;最佳封闭液浓度为1%BSA-PBS;最佳抗原包被量为8μg/mL;血清最佳稀释度为1∶300;血清最佳作用时间为1 h;二抗的最佳稀释度为1∶5000;二抗最佳作用时间为1 h;底物最佳显色时间为25 min。重复性试验、特异性试验和对比试验结果显示,建立的ienv-ELISA方法有良好的可重复性,标准差均小于15%;与鸡MDV、ALV、NDV、H5N1、H9N1等病毒阳性抗体均无交叉反应;与REV抗体检测试剂盒（以REV全病毒为包被抗原）对比,所建立的ienv-ELISA诊断敏感性、诊断特异性以及准确率分别为90.625%9、3.75%和92.7%。 相似文献