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1.
为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。 相似文献
2.
【目的】获得牛环形泰勒虫(Theileria annulata)新疆株enolase基因,并分析其生物学特性及反应原性。【方法】对牛环形泰勒虫enolase基因进行扩增和克隆,构建原核表达载体pGEX-4T-1-enolase,诱导表达enolase重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证enolase重组蛋白反应原性。利用生物信息学方法对enolase基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化、亚细胞定位及蛋白互作网络进行预测分析。【结果】PCR扩增出大小为1 248 bp的牛环形泰勒虫enolase基因片段,enolase重组蛋白大小约70 ku;Western blotting结果表明,该重组蛋白与牛环形泰勒虫阳性血清发生反应。enolase基因编码416个氨基酸,理论等电点为5.91,有38个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋(43.03%)和无规则卷曲(33.17%)组成;具有17个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要位于细胞质中;enolase蛋白与磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、热休克蛋白70(HSP70)存在相互作用。【结论】本试验成功克隆出新疆牛环形泰勒虫enolase基因,蛋白互作网络预测其与糖酵解和能量代谢相关的蛋白相互作用。研究结果为牛环形泰勒虫能量代谢途径基因的相关研究奠定基础。 相似文献
3.
旨在克隆、表达环形泰勒虫HSP90基因并筛选与其结合的中药单体。对新疆地方环形泰勒虫株HSP90基因进行PCR扩增、克隆测序，并构建系统进化树。对HSP90蛋白理化特性、高级结构与亚细胞定位进行预测分析。构建原核表达载体HSP90-pET32a,筛选诱导表达条件，经镍株纯化重组蛋白并用Western blot检测其免疫原性。使用DrugRep服务器对靶向环形泰勒虫HSP90的中药单体筛选。结果显示，HSP90基因编码的蛋白序列与小泰勒虫序列(登录号：XP 766455)同源性较高。HSP90蛋白编码223个氨基酸，理论pI为8.4,具有28个磷酸化位点。HSP90蛋白二级结构以α-螺旋(66.37%)和无规则卷曲(19.28%)为主，存在多个B细胞抗原表位，亚细胞定位主要分布于细胞质。HSP90-pET32a蛋白相对分子质量约50 ku, 0.2 mmol/L IPTG诱导3 h蛋白表达较好。Western blot结果显示，该蛋白具有较好的免疫原性。经虚拟筛选，发现了5种与环形泰勒虫HSP90有较好结合力中药单体，其中圣草次甙结合力最强(affinity=-8.5 kJ/mol),作... 相似文献
4.
根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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为了研究山羊热休克蛋白70（HSP70）家族成员HSPA6基因编码蛋白的结构与功能特性,本研究利用生物信息学方法,分析了山羊HSPA6基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化修饰位点、亚细胞定位,以及蛋白的二级结构和三级结构;选取多种生物的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树,另外还对HSPA6进行了蛋白互作网络分析。结果显示,山羊HSPA6蛋白序列与哺乳动物（牛、猪）的序列同源性较高;山羊HSPA6蛋白分子质量为70.9 ku,理论等电点为5.78,属于酸性蛋白和亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;蛋白质功能预测结果显示,HSPA6包含10个分值很高的可能磷酸化位点,这些位点分布在N-端的核苷酸结合结构域（NBD）和C-端的多肽结合结构域（PBD）。经序列分析发现,HSPA6 C-端含有EEVD基序,是HSP70家族蛋白定位于细胞质的保守基序,表明HSPA6主要分布在细胞质。蛋白质二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占41.52%和33.75%,为混合型蛋白;蛋白互作网络构建结果显示,和HSPA6相互作用的蛋白包括HSP70家族成员,另外也有HSP40、HSP90家族成员,预示着山羊HSPA6可能在细胞内与HSP40和HSP90形成复合体发挥作用。本试验结果为进一步深入探讨山羊HSPA6响应环境应激的功能机制提供了理论依据。 相似文献
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为了研究环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的功能,本试验利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增环形泰勒虫GAPDH (TaGAPDH)基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,融合蛋白纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,分别用间接ELISA和Western blotting检测抗体的效价和特异性;利用激光共聚焦荧光显微镜观察TaGAPDH蛋白在环形泰勒虫裂殖体中的亚细胞定位.结果显示,克隆得到了TaGAPDH全长基因,大小为1 020 bp;SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白大小约44 ku,且以包涵体形式存在.制备的多克隆抗体效价高达1:12 800,具有很高的特异性;亚细胞定位显示TaGAPDH蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体细胞质内.以上结果表明本试验成功克隆表达了TaGAPDH基因,并制备了针对TaGAPDH蛋白的兔多克隆抗体,为筛选环形泰勒虫病疫苗、药物靶点及研究环形泰勒虫能量代谢奠定了基础. 相似文献
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构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。 相似文献
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新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达 总被引：3，自引：0，他引：3
采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础. 相似文献
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【目的】 探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】 根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】 试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】 本研究成功克隆PEDV 截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。 相似文献
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ZHAO Hong-xi LIU Jun-long YANG Cong-shan ZHAO Shuai-yang LIU Juan LIU Guang-yuan YIN Hong GUAN Gui-quan LUO Jian-xun 《中国畜牧兽医》2016,43(2):304-310
In order to study the function of the Theileria annulata (T.annulata) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),the T.annulata GAPDH (TaGAPDH) gene was amplified by PCR from the cDNA of T.annulata,and cloned into the pET-30a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3).After purification,the fusion protein was injected into rabbits to produce polyclonal antibodies.Specificity and titers of the polyclonal antibodies were determined by ELISA and Western blotting,and subcellular localization of TaGAPDH protein was observed by confocal fluorescence microscope.The results showed that TaGAPDH gene was approximately 1 020 bp;SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein was expressed in BL21(DE3) with 44 ku in molecular mass,and highest expressed level was detected in the inclusion.The titer of the polyclonal antibodies was more than 1:12 800.The results of western blotting indicated that the polyclonal antibodies possessed good specificity,and TaGAPDH protein was predominantly present on the cytoplasm of T.annulata schizont by subcellular localization.This study laid the foundation for screening and identifying candidate antigens of vaccination and drug targets as well as studying the energy metabolism of T.annulata. 相似文献
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为研究急性冷应激通过影响热休克蛋白含量的变化对阿勒泰羊抗寒性能、生产性能及抗病性能等的影响,试验设置常温组（15 ℃±2 ℃）与冷应激组（-25 ℃±2 ℃）,每组各5只羊,屠宰后分别采集急性冷应激组（冷应激24 h后）和常温组的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织。采用实时荧光定量PCR技术对HSP60、HSP70和HSP90 mRNA含量变化进行检测,并对HSP60、HSP70和HSP90基因进行同源性分析。结果显示,HSP70和HSP90基因与已有绵羊序列同源性高于99%,而HSP60基因与已有波斯金牛序列同源性高于99%;冷刺激后HSP60基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肾脏中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP70基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP90基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏组织中表达量差异显著（P<0.05）,而在脾脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）。表明急性冷应激极大程度地刺激了机体的产热机能,通过通路中的产热相关基因的相互调节使其能量代谢发生改变,从而提高细胞生存率,增强机体对环境胁迫的耐受力,能更好地适应环境温度的变化。试验结果为进一步深入研究急性冷应激对阿勒泰羊机体的影响提供一定理论依据。 相似文献
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本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni2+柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。 相似文献
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为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D450 nm值≥ 0.30为阳性,样品D450 nm值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。 相似文献
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试验旨在克隆鸭疫里默氏杆菌协同溶血素蛋白(cooperative hemolysin protein,CAMP)基因,并对其进行原核表达和生物信息学分析。以RA贵州血清2型分离株RA-SS-8基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌CAMP基因,构建pET-28a-CAMP重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,重组菌用IPTG进行诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用相关生物信息学分析软件对CAMP基因进行分析。结果显示,鸭疫里默氏杆菌CAMP基因大小为1 026 bp,该基因序列与GenBank中公布的10株RA参考菌株(如RA-LZ01(CP045564.1))CAMP基因的相似性达99.7%。经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,获得大小约5 369和1 026 bp的基因片段,表明pET-28a-CAMP重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,表达的重组蛋白大小约为37 ku,以可溶形式进行表达,且能与His-tag单克隆抗体在37 ku处产生特异性反应,与预期结果相符。生物信息学分析表明,CAMP蛋白分子式为C1670H2659N437O500S12,含341个氨基酸,理论等电点(pI)为5.62,不稳定系数为40.71,表明其为不稳定的弱酸性蛋白。疏水性预测结果显示,该蛋白属于亲水性蛋白。CAMP蛋白无跨膜结构域,无信号肽,有3个O-糖基化位点,无N-糖基化位点,存在34个磷酸化位点,共有17个抗原表位。二级结构和三级结构预测结果显示,CAMP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验结果为进一步研究鸭疫里默氏杆菌CAMP蛋白的功能及鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研发提供了参考。 相似文献
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试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155 bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70 ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8 mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8 mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著（P>0.05）。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。 相似文献