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为了对疑似新发猪圆环病毒3型(PCV-3)感染病例进行确诊,试验采用PCR技术鉴定1例疑似感染PCV-3的猪,并将鉴定得到的PCV-3毒株的全基因组分成2个片段进行PCR扩增,分别构建到pMD18-T载体上测序,通过MegAlign软件对全基因序列进行同源性和遗传进化分析,利用在线生物信息学软件预测Cap和Rep蛋白的信号肽、核定位信号和B细胞表位。结果表明:成功鉴定出1株豫北新发PCV-3毒株,将此毒株命名为PCV-3/CN/HNAY-201806;对2个基因片段测序后拼接发现其基因组长度为2 000 bp(登录号为MH683051);同源性和遗传进化分析显示,PCV-3/CN/HNAY-201806与吉林长春毒株PCV-3/CHN/JLCC2016(登录号为KY421348.1)核苷酸同源性(99.6%)较高,与广西毒株PCV-3/GXFC2017-7(登录号为MG250186.1)同源性(98.8%)较低,不同地区间PCV-3基因组有差异但较小;对该毒株Cap和Rep蛋白序列分析显示,2个蛋白都没有信号肽序列,但都有核定位信号,Cap蛋白有9个B细胞表位,Rep蛋白有14个B细胞表位。 相似文献
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为了探索猪Ig G1-Fc(pIgG1-Fc)与猪圆环病毒3型(PCV-3) Cap融合基因在大肠杆菌中的表达效果,试验采用PCR方法扩增pIgG1-Fc-Cap136～645融合基因,通过PCR和双酶切技术鉴定重组质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc-Cap136～645,使用SDS-PAGE和Western-blot方法对该重组质粒进行原核表达与鉴定,并进行可溶性分析。结果表明:PCR扩增得到pIgG1-Fc-Cap136～645融合基因,大小为1 221 bp,共编码407个氨基酸,并成功构建重组质粒pET30a(+)-p IgG1-Fc-Cap136～645;该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得表达,表达的融合蛋白分子质量约为53. 0 ku,在25℃、IPTG终浓度为0. 5 mmol/L、诱导8小时时,重组蛋白pIgG1-Fc-Cap136～645的表达量最高,且主要以包涵体形式表达。 相似文献
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为了探索猪IgG1-Fc(pIgG1-Fc)基因在大肠杆菌中的高效表达,首先通过反转录PCR(RT-PCR)扩增pIgG1-Fc基因,并构建重组表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,然后通过优化异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、菌体培养温度及菌体培养时间,实现pIgG1-Fc重组蛋白的高效表达。结果表明,成功克隆了pIgG1-Fc的基因666 bp,共编码222个氨基酸;重组原核表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc经过酶切和测序证明构建正确,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达,表达的融合蛋白分子量约为36 ku。其最佳表达条件如下:在25℃条件下加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导6 h可形成大量包涵体蛋白。pIgG1-Fc基因被成功克隆并原核表达,为进一步研究该蛋白的功能及实现其他蛋白与pIgG1-Fc融合后原核表达奠定了基础,为制备能与猪IgG1结合的二抗提供了材料。 相似文献
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为了解豫北地区规模化养殖场猪源大肠杆菌的耐药性及基因多态性,对分离的21株猪源大肠杆菌进行药物敏感实验,采用PCR技术对其耐药基因进行检测,RAPD技术进行基因多态性分析。结果表明:豫北地区规模化养殖场分离的猪源性大肠杆菌菌株对常见16种抗生素存在不同情况的耐药性。其中对四环素、红霉素、麦迪霉素、阿莫西林、磺胺异恶唑、环丙沙星、新生霉素、复方新诺明、恩诺沙星、甲氧苄啶的耐药率均为100%,对庆大霉素、洛美沙星的耐药率为85%以上,对其他药物的耐药率相对较低;PCR检测得到8种耐药基因的条带;对菌株进行RAPD分析得到7种不同的基因型。大肠杆菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。豫北地区猪源大肠杆菌感染多重耐药十分严重,严重影响了该地区猪源大肠杆菌病的诊治和预防。 相似文献
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为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。 相似文献
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为评价一种新型黏虫抗菌肽（armyworm antimicrobial peptide 1，AAP-1）的抗菌活性，本试验首先采用固相化学合成法合成AAP-1，并通过高效液相色谱纯化和质谱检验，用抑菌圈法测定AAP-1对大肠杆菌的抗菌效果，倍比稀释法检测最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），细菌平板计数法测定时间抗菌曲线；最后，通过超微量分光光度计评价AAP-1对大肠杆菌核酸泄露的影响，核酸凝胶电泳评价AAP-1对大肠杆菌胞内DNA的影响，透射电子显微镜观察评价AAP-1对大肠杆菌的整体作用效果。结果表明，合成的AAP-1纯度高于98%，分子质量为4 262.17 u；AAP-1对大肠杆菌具有良好的抗菌活性，MIC为7.8 μg/mL；对大肠杆菌的抗菌作用具有浓度依赖性，且在60 min内抗菌效果逐渐增强；AAP-1能够导致大肠杆菌核酸泄露，致使胞内DNA总量减少，且呈现浓度依赖性；AAP-1也会导致大肠杆菌细胞膜破坏、胞内电子密度明显降低、胞质溶解等现象。综上，本研究化学合成了一种新型抗菌肽AAP-1，且纯度高达98%，其对大肠杆菌具有良好的抗菌效果。本研究可为深入研究AAP-1对大肠杆菌的抗菌机制提供前期数据，可为APP-1的临床应用奠定理论基础。 相似文献
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【目的】 探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】 根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】 试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】 本研究成功克隆PEDV 截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。 相似文献
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