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试验旨在构建pET28a-DCpep-GSE原核表达载体，并制备猪链球菌（Streptococcus suis）重组表位蛋白。应用生物信息学方法预测猪链球菌保护性抗原三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、烯醇化酶（Enolase）、DNA核酸酶（SsnA）的跨膜区结构、信号肽、B细胞表位、辅助T细胞（Th细胞）表位及蛋白的二级结构；设计重组蛋白（DCpep-GSE蛋白）的氨基酸序列并分析其理论等电点、亲疏水性等理化性质；构建重组原核表达载体pET28a-DCpep-GSE，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，优化诱导表达条件，His镍柱纯化并检测目的蛋白的细胞毒性和溶血性。结果显示，SsnA蛋白第1-50及1 036-1 059位氨基酸为胞内或跨膜片段，第1-56位氨基酸为信号肽片段，GAPDH和Enolase无跨膜区及信号肽；B细胞和Th细胞表位处于二级结构中的无规则卷曲与β-转角区域，表位抗原性良好；DCpep-GSE蛋白共373个氨基酸，分子质量为45.3 ku，理论等电点（pI）为4.57，平均亲水性（GRAVY）为-0.677，属于酸性亲水性蛋白；质粒双酶切得到5 369 bp的载体条带和1 131 bp的目的条带，PCR扩增产物测序结果与设计序列一致，载体构建正确；以1 mmol/L IPTG于37 ℃诱导6 h蛋白表达量最高，超声破碎后得到可溶性蛋白；试验组蛋白浓度为500 μg/mL时，RAW264.7、PK15和MARC145细胞的相对增殖率分别达到92.3%、99.5%和99.7%，细胞形态与对照组一致，生长旺盛；各样品组的溶血率均<5%。本研究设计了重组蛋白DCpep-GSE，成功地表达和纯化了DCpep-GSE蛋白，并验证了其安全性，为后续猪链球菌病亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测 总被引：1，自引：1，他引：0
将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。 相似文献
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对土耳其棓子的抑菌活性成分进行研究.采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、制备薄层色谱、HPLC,对土耳其棓子中的化学成分进行分离,通过理化性质和光谱数据鉴定其结构,采用抑菌试验对土耳其棓子不同提取部位和单体化合物进行抑菌活性筛选.分离得到7个化合物,分别鉴定为:没食子酸(Ⅰ)、间-二没食子酸(Ⅱ)、对-二没食子酸(Ⅲ)、没食子酸甲酯(Ⅳ)、没食子酸乙酯(Ⅴ)、1,2,3,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(Ⅵ)和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(Ⅶ).土耳其棓子乙酸乙酯部位含主要抑菌活性成分,其中化合物Ⅲ和Ⅴ均为首次从该棓子中分离得到. 相似文献
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通过筛选牛蛙皮肤cDNA文库得到具有较强抗菌抗肿瘤活性肽Catesbeianin-1a,合成其成熟肽氨基酸序列,MIC法测定抑菌活性结果表明,Catesbeianin-1a对临床常见的致病菌具有较强的抑菌活性,其中对猪链球菌2型的MIC为2.5mg/L,且对兔红细胞几乎无溶血性。MTT法测定多肽抗肿瘤细胞活性,结果 Catesbeianin-1a对胃癌细胞和肝癌细胞的抑杀活性很强,对肝癌细胞SGC7901的IC50为0.845mg/L。制作透射电镜超薄切片,利用透射电镜观察活性肽对细菌和肿瘤细胞超微结构的影响,旨在初步探讨牛蛙皮肤活性肽Catesbeianin-1a抗菌、抗肿瘤的作用机制,并以Catesbeianin-1a为基础进行分子改造来提高其抗肿瘤的靶向性并降低其毒性。 相似文献
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试验旨在研究新发现的两种牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种肿瘤细胞体外增殖的影响,为新的多肽抗肿瘤药筛选提供依据。本试验利用圆二色谱(CD)法检测两种新牛蛙活性肽的二级结构,通过MTS细胞毒试验测定不同浓度的两种新牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种瘤细胞体外增殖的影响。圆二色谱法结果显示,Temporin-Lb的二级空间结构为聚脯氨酸Ⅱ型螺旋(PPⅡ)结构,Catesbeianin-1a的二级空间结构为无规则卷曲。MTS细胞毒试验结果显示,给予Catesbeianin-1a的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞形态无明显变化,正常增殖,而给予Temporin-Lb的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞发生皱缩、细胞变圆、脱落甚至死亡,增殖受到抑制,其中对Temporin-Lb在4~40 μmol/L浓度范围内对小鼠白血病细胞K562的抑制效果最为明显。结果表明,新牛蛙活性肽Temporin-Lb具有一定的抑瘤作用,Catesbeianin-1a对瘤细胞的体外增殖没有明显影响。 相似文献