嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救     

左智敏  康洪涛  吴红霞  祖少坡  田进  刘永相  倪宏波  曲连东 《中国预防兽医学报》2019,(7):759-762,766

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。  相似文献   

兔出血病病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

胡迎东  刘怀然  司昌德  刘家森  韩凌霞  姜骞  曲连东 《动物医学进展》2006,27(5):87-90

为快速检测兔出血病病毒,参照RHDV-TP株VP60基因序列(GenBank Ac-ession AF453761),在其5′端设计一对引物,扩增片段为386 bp,建立了检测兔出血病病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化,确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已知病原的病料中,可特异性检出RHDV,检测病料的最高稀释度为10-5倍,且有很好的稳定性。临床样品检测结果显示,该方法的敏感性要高于血凝抑制试验,从而建立了RHDV特异、敏感的RT-PCR检测技术,可应用于RHDV临床诊断及流行病学调查。  相似文献   

EIAV基因转移载体转录后调控元件的优化     

李亚明  韩凌霞  曲连东 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2008,36(2):1-6

【目的】为了提高马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体质粒pcPPTPRE(+)的外源蛋白表达能力,对其转录后调控元件进行优化。【方法】将PCR扩增土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV)转录后调控元件(WPRE),克隆于pGM-T载体获得重组质粒pGM-WPRE,利用NotⅠ酶将WPRE亚克隆入pcPPTPRE(+),筛选WPRE正向连接的重组质粒pcPPTWPRE,采用磷酸钙法分别将pcPPTWPRE和pcPPTPRE(+)转染HEK293细胞和DF-1细胞,利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达,利用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP阳性细胞的表达率。【结果】在HEK293细胞中,pcPPTWPRE表达外源基因的能力极显著优于pcPPTPRE(+);在DF-1细胞中,pcPPTWPRE与pcPPTPRE(+)表达外源基因的能力均不强,但前者略优于后者。【结论】土拨鼠肝炎病毒转录后,调控元件(WPRE)可以明显增强EIAV载体质粒的外源蛋白表达能力,为高表达能力伪型EIAV重组病毒的获得奠定了基础,同时也为其他病毒载体的构建提供了借鉴。  相似文献   

同时检测犬瘟热病毒和犬细小病毒双重PCR方法的建立     

刘大飞  姜一曈  杨天阔  林欢  刘春国  柴洪亮  王翀  崔英玲  姜晓飞  马旭青  刘大程  华育平  曲连东  张洪英 《中国预防兽医学报》2012,(3):211-213

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。  相似文献   

同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘大飞  姜一曈  戚亭  程景  刘立奎  林文君  柴洪亮  杨天阔  王翀  华育平  曲连东  张洪英 《中国预防兽医学报》2012,34(11)

为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV (507 bp)、CPV (287 bp)、CAV-Ⅰ (590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法.实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9 TCID50、101.7 TCID50、101.7 TCID50和102.2 TCID50.利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33％(7/30)、CPV阳性率为20％(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33％(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断.  相似文献   

同时检测猫细小病毒、杯状病毒、疱疹病毒1型多重PCR方法的建立简     

王翀  刘大飞  刘春国  柴洪亮  张洪英  程景  吕健  华育平  曲连东 《中国预防兽医学报》2014,(1):31-33

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流行性感冒病马病理变化的观察     

褚桂芳  相文华  曲连东  王继科  刘洪  蔡虹  尹训南 《中国预防兽医学报》1996,(4)

1994年春青海省暴发马流行性感冒。发病后3天迫杀的和发病后10天自然死亡的各一例进行了病理解剖学、病理组织学和超微病理学的观察。病程前期主要病理变化是上呼吸进出血性卡他性炎症,全身内脏器官充血、水肿、出血等血循环紊乱变化。病程后期主要病理变化是全身各内脏器官充、出血、水肿和实质细胞变性坏死,特别是中枢神经系统和内分泌器官更为显著,并伴有明显的浆液、出血性肺炎和出血性卡他性肠炎。本文就马流行性感冒病变的发生、发展进行了讨论。  相似文献   

猪断奶后多系统衰竭综合征诊断方法及标准的建立     

崔尚金  李曦  符芳  曲连东  童光志 《当代畜牧》2005,(2):31-34

猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)是一种由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)引起的新病。PCV是1974年在猪肾传代细胞系PK-15中发现的一种污染病毒，该病毒不产生细胞病变效应(CPE)，无致病性，命名为PCV1；而后在PMWS中分离的猪圆环病毒，有致病性，命名为PCV2。PMWS主要感染1～5月龄的猪，发病率为4％～30％，致死率为70％～80％。患病断奶猪和生长猪临床表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、黄疸、腹泻和体表淋巴结肿大，  相似文献   

非洲猪瘟研究进展     

曲连东  于康震 《中国兽医科技》1998,28(11):32-43

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ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用     

孙宏勇  刘家森  王泽祥  陈淑慧  单丽玲  郭冬春  姜骞  林欢  曲连东 《中国预防兽医学报》2013,35(9)

为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中进行表达.重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH.利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用.结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关.本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系.  相似文献