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11.
犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
以pVAX1为载体首次构建了犬冠状病毒病基因的3种真核表达质粒。首先将犬冠状病毒大熊猫株(CCVDXMV)纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。将测序后的质粒pTS、pTM和pTN分别双酶切,回收目的基因片段并将其定向克隆到真核表达质粒pVAX1中得到重组质粒pVAXS、pVAXM和pVAXN。将这3种真核表达质粒通过脂质体介导法转染MDCK细胞,通过RT—PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白的表达情况。结果在pVAXS、pVAXM、pVAXN转染MDCK细胞36h后就可检测到目的基因的转录;在转染72h后可检测到3种目的蛋白的表达。动物免疫试验表明,3种真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫与体液免疫应答,这为CCV基因疫苗的研究奠定了良好的基础。 相似文献
12.
以犬细小病毒基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增了全长VP1基因,PCR产物经纯化和NotⅠ/BamHⅠ双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接,转化到感受态细胞JM109中,筛选了真核重组表达质粒pIRESVP1,并进行了序列测定。对6只9月龄犬分别接种不同剂量的pIRESVP1或空载体质粒及生理盐水,8周接种1次,每次接种前采血,测定血清的血凝抑制抗体效价,第2次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第3次接种4周后,对全部实验犬进行攻毒,攻毒后第7天及第14天时采血,测定血清的血凝抑制抗体效价。所有接种pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV强毒的攻击,而接种空载体质粒和生理盐水的对照犬则全部发病。证明所构建的核酸疫苗(pIRESVP1)能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。 相似文献
13.
14.
大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒,经鉴定为犬冠状病毒(命名为CCV DXMV)。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2,以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14,分段扩增了CCVDXMV株部分S基因,得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中,通过筛选和鉴定,获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序,将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列,拼接成全S基因序列,并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较,绘制进化树。结果表明,该株病毒与CCV K378株的同源性最高,达到99.4%;而与CCV 23/03株的同源性最低,为56.9%;与FIPV和TGEV分别有90.4%和82.1%的同源性。 相似文献
15.
利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒(CPV-VLPs),采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为:纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。 相似文献
16.
早在 8 0年代中期 ,国外就已研制出弱毒苗和灭活苗对犬进行免疫研究 [1,2 ] ,国内开展犬冠状病毒( CCV)的研究起步较晚 ,但发生 CCV性肠炎的报道很多 ,且远比国外报道的严重。 1 997年 ,胡桂学等 [3 ]利用犬胎原代细胞从一肠炎犬病料中成功分离获得 1株 CCV强毒 YS1株 ,随后我们采用静水压和 BEI灭活病毒的方法对该株强毒进行灭活 ,研制出两种新型的犬冠状病毒灭活苗 ,并对犬进行了免疫试验 ,同时我们还应用反转录 -聚合酶链反应( RT- PCR)技术对免疫后犬组织中的犬冠状病毒进行检测 ,并设立了传统的犬冠状病毒福尔马林灭活苗免疫犬… 相似文献
17.
应用致敏SPA菌体提高CAV/CPV PCR检出率的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为消除粪便等病料中的PCR干扰物质 ,提高犬腺病毒与细小病毒 (CAV CPV)联合PCR检出率。根据免疫吸附的原理 ,应用CAV CPV高免血清致敏含A蛋白的金黄色葡萄球菌 ,制成致敏SPA菌体免疫吸附剂 ;以此免疫吸附提取粪便等病料中的CAV/CPV ,然后直接或经 3 5mol/LMgCl2 将所吸附病毒洗脱后再做PCR。结果 8份经电镜负染或HA/HI试验验证为阳性的粪便样品 ,如此处理后进行PCR检测 ,结果均为阳性 ;而直接取粪便离心后用上清进行PCR检测 ,结果均为阴性。表明该法可有效去除待检样品中的PCR干扰物质 ,提高PCR的检出率。 相似文献
18.
犬细小病毒分离鉴定及其基因型调查的基础研究 总被引:5,自引:0,他引:5
用F81细胞从不同地区送检的25份肠炎犬病料中分离出10株细小病毒,经形态学,理化学,生物学和分子病毒学等鉴定,结果这10株病毒均能在F81细胞上生长,产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变;病毒粒子呈立体对称,直径为20~24nm,无囊膜,抗氯仿,耐酸,耐热,能被5-IUDR抑制,可凝集猪、马、猫的红细胞,不能凝集人、鸡、豚鼠、兔的红细胞,HA试验能被抗CPV的特异性抗体所抑制,用犬细小病毒(CPV)特异性引物对10株病毒进行PCR扩增,结果扩增片段与阳性对照大小一致(771bp),用PV/犬/JL/1/02、PV/犬/BJ/1/99和PV/犬/GZ/1/02三个毒株进行人工感染犬试验,结果人工感染犬在接种后白细胞总数出现短期不同程度的下降,在攻毒后4~14d粪便PCR检查阳性,其中接种PV/犬/BJ/1/99的一只犬出现严重的肠炎症状并死亡,其余接种犬没有出现明显的临床症状,但血清抗体均升高(大于5倍),而对照组的白细胞总数和血清抗体没有明显的变化,粪便PCR检测阴性,表明所分离毒株能够感染犬,鉴定结果证明,CPV在我国犬群中仍广泛存在。 相似文献
19.
根据GenBank中已发表的CAV纤突基因序列,设计合成4对8条引物,用已建立的PCR方法,对犬2型腺病毒沈阳分离株第5代强毒经蚀斑克隆驯化的第60代毒弱毒(SY-V60)和犬1型腺病毒长春犬株(CCC-V6)的纤突基因进行了扩增,PCR产物经纯化后进行基因序列测定,测定结果经拼接后得到一个由1632和1629个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列,分别编码543和542个氨基酸。犬2型腺病毒(SY-V60)与犬1型腺病毒(CCC-V6)的纤突基因的同源性达到80.48%。犬2型腺病毒(SY-V60)与犬1型腺病毒(CCC-V6)纤突基因的同源性达到80.48%;根据犬的腺病毒与人2型腺病毒纤突蛋白的序列同源性比较结果,推测了犬腺病毒纤突蛋白的尾(tail)、轴(shaft),结(knob)三个功能区的氨基酸序列,2个型之间的尾区同源性为76.9%;轴区同源性为78.59%;其结区同源性为83.24%,而同型毒株之间结和尾区同源性较高,轴区同源性较低。 相似文献
20.
犬传染性肝炎病毒的血凝抑制抗体和中和抗体的关系 总被引:2,自引:0,他引:2
犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus,ICHV)能诱导动物机体产生中和(Serum neutrolization,SN)抗体与血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)抗体,本研究对8份ICHV免疫的犬血清同时进行了其SN抗体和HI抗体的检测,结果表明SN抗体和HI抗体具有正比线性关系SN≈8×HI,并绘制了标准曲线。由于血凝和HI试验不需应用活的试验宿主系统,而且可在3 h内获得结果,操作经济简便,因此可通过测定HI抗体的效价来推算出SN抗体效价。 相似文献