猪源TTV Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用     

侯军委  周艳君  王礞礞  李国新  于海  童光志 《中国兽医寄生虫病》2011,19(2):13-19

根据TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品分别绘制标准曲线,TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。检测结果显示,两种方法的灵敏度均可达10 copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。检测采集自广西和内蒙古的44份病料,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。  相似文献   

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立     

黄梦  于海  周艳君  李泽君  马继红  杨馥如  童光志 《中国兽医寄生虫病》2011,19(3):19-22

利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。  相似文献   

吉林玉米带春季土壤水分变化对玉米幼苗生长状况的影响   总被引：1，自引：0，他引：1  

马树庆  王琪  徐丽萍  于海  张铁林 《中国农业气象》2014,(1)

2010年和2011年春季,在吉林省中部玉米主产区开展玉米分期播种和土壤水分胁迫田间试验,每年均设3个播期和4个水分处理,观测播种-7叶期间的土壤水分、灌水量、降水量、气温,以及7叶期后的玉米发育期株高、叶龄和生物量,采用回归分析方法分析土壤水分变化对玉米长势的影响。结果表明,春季土壤持续缺水抑制玉米幼苗茎叶生长,减缓生物量积累。玉米相对叶龄、相对株高和相对干重(均为与对照相比)与播种-7叶期平均土壤湿度间均为显著的二次函数关系,土壤湿度每降低1个百分点,玉米苗期相对叶龄、相对株高和相对干重分别降低5.5、5.6和11.0个百分点。0-20cm土层平均土壤湿度在21.5%~24.0%(或同期土壤有效水量在70~85mm)时最适合玉米幼苗生长;土壤湿度降至18%,则玉米苗相对叶龄、相对株高和相对干重分别从适宜土壤湿度条件下的100%降至80%、85%和70%左右;当土壤湿度处于16%以下时,相对叶龄、相对株高和相对干重分别降至68%、70%和50%以下。研究结果对玉米苗情评价、春旱影响评估及灌溉均具有指导意义。  相似文献   

政府在农村经济发展中的环保责任分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

于海 《安徽农业科学》2006,34(18):4748-4749,4776

从农业生态环境所面临的严峻问题出发,从宏观的角度分析了农业生态环境恶化趋势尚未有效遏制的原因,提出了强化政府环保责任的对策措施。  相似文献   

H1亚型流感病毒通用疫苗的构建及其对小鼠免疫保护效力研究     

杨馥如  于海  王斌  黄梦  马继红  温峰  周艳君  童光志 《畜牧兽医学报》2013,(2):240-249

本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。  相似文献   

登海605不同播期试验研究     

姜大奇  刁立功  李梅  王金华  曲士海  于海 《山东饲料》2013,(2):293-294

为探讨牟平区夏玉米高产栽培适宜播期,以登海605为试验材料,研究了夏玉米不同播期试验。结果表明:随播期的推迟,植株的叶片数呈逐渐减少的趋势,播种到抽雄期的生育天数逐渐减少,穗粒数、千粒重、实产依次降低。各项因素分析表明,登海605适宜播期在6月15日～6月21日,这期间播种既能保证玉米高产,还能不误小麦的适宜播期。  相似文献   

猪流行性腹泻病毒N基因的表达及抗原性分析     

吴玉璐  朱建平  杨莘  王亚欣  徐彦召  虞凌雪  于海  刘光清  童光志 《中国预防兽医学报》2013,35(4):299-303

为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。  相似文献   

猪流行性腹泻病毒M基因的表达及鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

吴玉璐  虞凌雪  程群  王康  于海  刘光清  童光志  周艳君 《中国动物传染病学报》2012,20(6):6-10

为了更好的研究近两年在我国爆发的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)疫情,本实验室收集不同发病地区的临床样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)RT-PCR检测,并挑选8个阳性样品对其M基因进行扩增,克隆和测序。序列比对的结果显示,8个分离株与14个参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是96.5%～99.9%和96.0%～100%,表明目前流行的PEDV其M基因是相对保守的。同时,我们将ZZ-1株的M基因克隆于原核载体pGEX-6p-1,转入菌株BL21中后获得了大量表达,重组蛋白大小约为50 kDa。利用PEDV阳性猪血清对纯化后的重组M蛋白进行Western blot分析,结果表明重组表达的M蛋白与临床阳性猪血清具有良好的免疫反应性。  相似文献   

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立     

马继红  于海  周艳君  李国新  闫丽萍  张善瑞  王斌  童光志 《中国兽医寄生虫病》2010,18(3):1-7

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。  相似文献   

中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒HA和NA基因的分子和遗传特征     

闫丽萍  周艳君  李国新  于海  童光志 《中国兽医寄生虫病》2010,18(4):13-19

目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素（haemagglutini,HA）基因和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）,以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。  相似文献