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为了解猪细环病毒(TTV)在无明显临床症状的猪群和不同发病猪群中的感染情况,本实验于2011年~2012年期间共采集江苏、安徽、天津、湖北、上海、浙江6个省份的无明显临床症状的母猪血清共488份,发病猪群样品352份,包括发生PMWS的猪血清及组织样品203份,发生PRRSV感染的猪群样品105份,发生流产的初产母猪血清23份,以及流产胎儿组织样品21份.对无明显临床症状的猪群进行TTV1和TTV2的病原学检测,对发病猪群样品进行TTV和PCV2、PPV4、PRRSV共感染检测,并对40条TTV1和32条TTV2的UTR部分基因分群区域进行测序和进化分析.结果显示,在488份无明显临床症状的母猪和种公猪中,猪源TTV1和TTV2感染率较高,分别为41%和67%,二者混合感染率为28%.PMWS发病猪样品中PCV2阳性率高达75%,PCV2和TTV2的混合感染高达61%.在PRRSV为阳性的病料中,TTV2的阳性率高达86%.在初产母猪和流产胎儿中,TTV1和TTV2的感染率,以及与不同病毒的混合感染率均高于健康猪群的感染率.对基因序列的进化分析表明,TTV1主要可以分为8个基因群,TTV2可以大致分为4个基因亚群.本研究为研究猪源TTV的潜在致病力以及分子进化提供了进一步的资料. 相似文献
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猪流行性腹泻病毒M基因的表达及鉴定 总被引:2,自引:0,他引:2
为了更好的研究近两年在我国爆发的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)疫情,本实验室收集不同发病地区的临床样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)RT-PCR检测,并挑选8个阳性样品对其M基因进行扩增,克隆和测序。序列比对的结果显示,8个分离株与14个参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是96.5%~99.9%和96.0%~100%,表明目前流行的PEDV其M基因是相对保守的。同时,我们将ZZ-1株的M基因克隆于原核载体pGEX-6p-1,转入菌株BL21中后获得了大量表达,重组蛋白大小约为50 kDa。利用PEDV阳性猪血清对纯化后的重组M蛋白进行Western blot分析,结果表明重组表达的M蛋白与临床阳性猪血清具有良好的免疫反应性。 相似文献
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根据A型流感病毒基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。 相似文献
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目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素(haemagglutini,HA)基因和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009(H1N1),以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用 总被引:6,自引:1,他引:5
本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测10^1拷贝/μL~10^7拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,比常规RT—PCR更敏感,可分别检测最少为10拷贝的阳性标准品和1TCID。病毒。用建立的方法检测高致病性变异株HuN4第5代和第65代体外传代细胞毒人工感染6周龄~7周龄仔猪后的0h、3h、5h、7h、10h、14h、21h血清样品,以及HuN4第5代病毒攻击仔猪21d后迫杀的猪的脑、心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织样品病毒含量,结果发现HuN4第5代病毒感染仔猪3d后在血液中迅速复制,并在感染后7d血清病毒含量达到最高峰,接近10^10拷贝/mL。攻毒21d后,上述内脏组织中肺脏含毒量最多,接近10^9拷贝/g。HuN4第65代病毒在人工感染猪后21d的血清病毒含量最高,达到10^6拷贝/mL血清。 相似文献
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通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstnduralprotein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11(^749KGEPvsdqpak^759)能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变(S754)处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸(^754SDQPAK^759)C端缩短到第3个氨基酸(^749KGEPVSDQ^757)时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。 相似文献
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流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE)是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1(1~291aa)、EF2(292~402aa)和EF3(403-500aa),又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1(1~88aa)、EF1—2(68~155aa)、EF1—3(129~222aa)和EF1—4(202~291aa),将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1~4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。 相似文献
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表达牛流行热病毒G基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验将克隆到 p BLG中的牛流行热病毒 (BEFV)糖蛋白 G基因亚克隆到含有 CMV启动子和 Poly(A)信号尾的 p CR3- Uni载体上 ,获得 p CR3- G重组体 ,酶切后将含有 CMV、G基因和 Poly(A)的目的片段 (约 3.6 kb)插入通用转移载体 pd TK- CMB中 ,获得 pd TK- CMB- G重组体 ;再将含 SV4 0启动子的 L ac Z报告基因也亚克隆到该载体中获得表达 BEFV G基因的pd TK- L ac Z- G转移载体 ,为开发 BEFV/IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and resp iratory syndrom e,PRRS)是以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为特征的传染病,PRRSV是该病的病原体。将PRRSV CH-1a株ORF6基因疏水性较强的区域删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达了M r约为37 000的融合蛋白rtM,W estern b lot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtM,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtM作为包被抗原,通过间接EL ISA方法筛选阳性克隆,结果获得了1株能稳定分泌抗rtM蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为M 2B3。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的单克隆抗体能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体M 2B3为IgG 1型,其轻链均为κ链。研究获得的融合蛋白rtM及单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析M蛋白的抗原表位等提供有益帮助。 相似文献
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高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
白细胞介素—10(IL-10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,用RT—PCR扩增了猪IL-10(poIL—10)编码基因,克隆并测序验证后,将其亚克隆到表达载体pPROEX^TM HTb中,转化DH5α后,用IPTG诱导培养,经免疫印迹和生物活性检测显示,重组菌株表达了具有活性的重组poIL—10,重组poIL-10表达水平达3mg/ml培养液,占菌体细胞总蛋白的30.2%,本研究为poIL-10的功能研究和临床应用奠定了基础。 相似文献