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应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因 总被引：1，自引：0，他引：1
将猪繁殖与呼吸综合征症病毒ＣＨ－ａｌ株囊膜糖蛋白（ＧＰ５）一向克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ中,与太毒线性ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ＾ＴＭＤＮＡ）共转染昆虫细胞ｓｆ９,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒ｒＢａｃ＝ＧＰ５。用该重组病毒感染ｓｆ９细胞后,应用间接免疫荧光试验、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,ＧＰ５基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基 相似文献
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为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用，在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上，采用点突变的方法对GP3蛋N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变糖去基化， 相似文献
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DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）HA基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果,本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA,同野生型A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS—optiHA和PCAGGS—HA,然后分别转染293T细胞,48h后采用间接免疫荧光的方法检测Ⅲ基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS—HA、PCAGGS—optiHA以100μg／只的剂量,采用后腿肌肉多点注射的方式,免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠,同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次,每次间隔2周,三免2周后对每组以10^3.87 EID50的A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平,攻毒后免疫组PCAGGS—optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS—HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIVDNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础. 相似文献
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为鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后,细胞内转录发生差异的基因,本研究采用抑制性消减杂交技术,以HP-PRRSV HuN4株感染后48 h的PAM细胞mRNA为实验方(Tester),以未感染的PAM细胞为驱动方(Driver)进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生上调的基因.反之,实验方与驱动方互换进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生下调的基因.将2种杂交所得的差异转录基因经PCR扩增后分别克隆到T载体中并转化大肠杆菌感受态细胞,从而构建了正向(上调)和反向(下调)的差异cDNA文库.随机挑取文库中的多个克隆用PCR方法进行鉴定,结果表明差异文库中的cDNA具有较好的多样性.本研究为下一步的文库克隆的序列测定与差异基因的功能分析奠定了基础. 相似文献
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本实验室2012年从江苏省太仓市某发病猪场分离到1株变异的伪狂犬病毒,命名为JS-2012。为了研究该分离株对仔猪的致病性,将12头15日龄的伪狂犬病毒阴性仔猪随机分为3组,其中2组（每组5头猪）分别通过肌肉注射和滴鼻接种JS-2012毒,第3组2头猪做空白对照。接种病毒的仔猪在攻毒后24 h体温均开始升高,4 d后开始死亡,死亡率为100%。临床观察发现,滴鼻组仔猪发病死亡明显快于肌肉注射组。对病死猪进行剖解,均可见大脑血管扩张并出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片显示猪的脑蛛网膜下腔严重出血,其他各脏器也均有严重病理变化。结果表明该变异株JS-2012为伪狂犬强毒毒株。 相似文献