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根据TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品分别绘制标准曲线,TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。检测结果显示,两种方法的灵敏度均可达10 copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。检测采集自广西和内蒙古的44份病料,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。 相似文献
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利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
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为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧光鉴定拯救的重组病毒,分别命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11,测序证实HuN4强毒nsp9、nsp10、nsp11片段正确替换入HuN4-F112骨架。拯救病毒在Marc-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24 h的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36 h后无明显差别。将拯救病毒以105TCID50剂量接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112 nsp10、rHuN4-F112 nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。 相似文献
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随着规模化养猪业的发展,传染性疾病越来越多,混合感染或多重感染十分普遍,给疾病的诊断和预防带来很大困难。本文将我们实验室2010年分别采自福建、广西、河南、上海、内蒙、浙江、江苏和山西等地发病猪场的185份病料,通过RT-PCR和PCR方法对其进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪繁殖障碍的猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）、细环病毒2（Torque teno virus 2,TTV2）等病毒检测。结果表明在所检的病料中PRRSV、PCV2和TTV2的阳性率比较高,分别为49.2%、62.2%和95.1%。有些地方TTV2的阳性率高达100%;同时,还存在很普遍的PRRSV与PCV2、PRRSV与TTV2、PCV2与TTV2等混合感染,混合感染率分别为27.6%、45.4%、58.4%;以及PRRSV、PCV2与TTV2的三重感染率为24.9%。同时对部分PRRSV阳性病料的PRRSV GP5和nsp2基因分别进行测序,分析测序结果表明病料中的PRRSV的GP5和nsp2序列与PRRSV HuN4株的相应序列的亲缘关系分别在98.2%和96.2%以上,且在nsp2区域都存在30个不连续氨基酸的缺失,说明现在临床中所流行的PRRSV可能仍是与高致病性PRRSV基因型相似的病毒。通过本文可以及时了解当前养猪场的病毒性疾病的流行情况,为猪场病毒性疾病的防控提供依据。 相似文献
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表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定 总被引：9，自引：3，他引：6
将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养,加入适当的保护剂制成冻干疫苗.取3批冻干疫苗,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种14日龄和50日龄SPF鸡,接种剂量为5
× 106PFU,接种后3天出现局部反应,5天局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对试验鸡是安全的.取其中的200003批疫苗,用生理盐水作210-2～210-5稀释后,翅内侧无血管处皮下接种40日龄SPF鸡,免疫后4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株,结果表明,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力,在接种剂量为210-2～210-40.1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应,当接种剂量为210-50.2ml/鸡时可以使部分试验鸡(5/15)产生局部反应,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210-40.1ml(相当于1000PFU).攻毒试验结果进一步证明,当接种剂量为210-40.1ml(相当于1000
PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒102株的攻击,降低鸡群的发病率和病死率.这些结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,疫苗对接种鸡的局部作用反应了疫苗的免疫效力,我们研制的重组疫苗的最小免疫剂量为1000
PFU,这就为我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用 总被引：10，自引：3，他引：7
将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH－1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒pET30a-N，将此重组质粒转化到受体菌BL21中，用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS－PAGE、Western-blot分析，并以此为包被抗原进行ELISA检测，结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，4小时后表达可达到高峰，其大小约为23kD，薄层扫描结果表明庐蛋白表达量约占菌体蛋白总量的32％，该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应，而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别，证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBond^TM纯化系统进行纯化，其纯度可达到91％，纯化后的蛋白以50μg/孔包被96孔板，检测来自不同地区送检的猪血清，同时以全病毒ELISA为对照，结果发现二者的符合率高达93．3％，而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感，且背景低，制备过程简单，这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。 相似文献
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病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。 相似文献