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有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将重组载体转化到枯草芽胞杆菌WB600中,用IPTG诱导重组菌表达,发酵液离心后取上清液,通过SDS-PAGE和Western blot方法分析蛋白表达情况。发酵上清液经Ni-IDA琼脂糖树脂纯化,与流感病毒HA抗原混合后共同滴鼻免疫小鼠后采集小鼠血清和支气管肺泡灌洗液检测IgG和IgA的抗体水平。结果显示：重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中能够分泌表达,在发酵罐中发酵36 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小在42 kDa左右,蛋白产量最高能到700μg/mL,Western blot检测目的蛋白正确表达。重组蛋白经过Ni-IDA琼脂亲和层析纯化后与HA抗原混和滴鼻免疫小鼠,ELISA结果显示CTA1-DD蛋白组针对HA抗原能够诱导更高的血清IgG和黏膜IgA抗体水平,说明枯草芽胞杆菌表达的CTA1-DD蛋白具有佐剂活性... 相似文献
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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和插入的特征设计并合成了1对特异性引物,首次建立了PEDV变异株的RT-PCR检测方法。结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,不和PEDV经典毒株反应,也不与其他动物病原反应;敏感性较高,最低可检测10~(-3)ng/μL,且重复性较好。用该方法对2013—2014年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果发现109份样品(34.3%)为PEDV变异株阳性,表明我国腹泻猪群中PEDV变异株感染较为普遍。本研究建立的PCR方法可以作为PEDV变异株在临床上的一种鉴别诊断技术。 相似文献
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[目的]本试验旨在探究免疫增强剂CVC1302促进淋巴滤泡生发中心(GC)应答的作用机制.[方法]将模式抗原4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗NP-CVC1302,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠.免疫后不同时间点,利用NP-BSA作为捕获抗原检... 相似文献
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重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得到稳定保护。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的粒径为50～150 nm, Zeta电位约-50 mV,质量浓度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制备的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒载药率25.33%,包封率86.56%。体外模拟释放试验结果显示CTA1-DD蛋白可在7 d内缓慢释放。将CTA1-DD蛋白与PRV灭活抗原混合后,接种至小鼠鼻腔,结果表明,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒能够同时诱导更高的血清IgG抗体和黏膜IgA抗体表达,证明了其作为黏膜佐剂的高效性。 相似文献
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[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。 相似文献
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为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具. 相似文献
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[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。 相似文献
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为探究免疫增强剂CVC1302诱导机体产生高亲和力抗体的免疫机制,本研究利用4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与免疫增强剂CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗。将33只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组,分别后腿肌肉注射NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL疫苗,50 μg NP-OVA/只,利用ELISA检测高亲和力NP特异性抗体水平;利用流式细胞仪分析生发中心B细胞增殖水平、生发中心 B细胞诱导活化的胞苷脱氨酶(AID)表达水平;利用荧光定量PCR检测AID基因和HoxC4基因转录水平。结果表明:1)免疫增强剂CVC1302可诱导小鼠产生高亲和力的NP特异性抗体。2)免疫增强剂CVC1302可显著提升抗原特异性生发中心 B细胞数量占总B细胞数量比例。3)免疫增强剂CVC1302可显著增加生发中心 B细胞HoxC4基因转录水平。4)免疫增强剂CVC1302可显著增强生发中心B细胞AID蛋白表达水平。生发中心B细胞表达的AID可针对B细胞免疫球蛋白序列可变区进行点突变,发生体细胞高频突变,提升B细胞BCR针对抗原的亲和力,进而在辅助性T细胞的阳性选择下分化为长寿浆细胞,持续性分泌高亲和力抗体,因此本研究推断免疫增强剂CVC1302依赖于正向调控AID诱导机体产生高亲和力抗体,为机体提供免疫保护力,以抵抗病原体的感染,为后续新型免疫增强剂的研制提供思路和理论基础。 相似文献
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