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为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。 相似文献
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用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究 总被引：11，自引：0，他引：11
根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列，设计了与PRV的gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRVDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重PCR扩增，均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明，多重PCR可以检测到106Pg三基因缺失疫苗毒或756PgPRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明，以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，均无任何条带。 相似文献
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根据GenBank上登录的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）基因组全序列，选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4，并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3，用引物P1／P4进行RT—PCR，然后用引物P2／P3／P4进行复合套式PCR，建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT—nPCR）的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段，与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT—nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明，有15份类似CDV强毒，5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT—nPCR可以有效检测CDV感染，能够将强、弱毒株区分开，可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。 相似文献
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为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。 相似文献
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吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定 总被引：5，自引：1，他引：4
将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫. 相似文献
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RT-PCR检测犬粪便中的冠状病毒 总被引：1，自引：2，他引：1
根据犬冠状病毒(caninecoronavirus, CCV) 的S基因序列, 用计算机设计并合成了1对引物P1、P2, 以此引物及以从美国进口的CCV疫苗的反转录产物为模板, 初步建立了检测CCV的RT PCR。将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM T easy载体中, 鉴定、测序并进行同源性分析。结果表明, 与1 71和UCD 1株同源性分别为91 5%和94 3%。该RT PCR能对疫苗中CCV及CCV参考株USCV B1的S基因进行特异性地扩增,长度为575bp, 对犬的其他病毒及CRFK细胞未能扩增出任何片段, 该RT PCR能检测出0 5μLCCV培养液/2g粪便。用建立的RT PCR在上海对50条犬粪便进行检测, 结果表明CCV阳性6例。本研究建立了检测犬粪便中的CCV的RT PCR, 能用于犬冠状病毒流行病学调查。 相似文献
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本研究建立了一种同时检测大肠杆菌和魏氏梭菌的二重PCR方法,根据兔肠致病性大肠杆菌(REPEC)的eae毒力基因和魏氏梭菌的α-toxin毒力基因的基因文库,设计了两对分别与eae基因和α-toxin基因互补的引物,用这两对引物对同一样品中的REPEC和魏氏梭菌模板进行二重PCR扩增。结果均得到了两条特异性大小与试验设计相符的833bp(REPEC)和324bp(魏氏梭菌)的扩增条带,而对其它3种病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该二重PCR技术能检出10cfu的REPEC,10cfu的魏氏梭菌。 相似文献
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应用PCR技术检测禽类源性成分 总被引：1，自引：0，他引：1
据禽类(鸽子、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸵鸟、鹧鸪)线粒体DNA 12sRNA基因中的保守序列,用Primer5.0设计针对禽类动物的特异性扩增引物。通过聚合酶链式反应从禽类样品中得到大约200bp的特异条带,而参考物种牛、羊、马、驴、鱼和空白对照则无此条带,说明该引物只对禽类有特异性,能将禽类与牛、羊、马、驴、鱼区分开来。通过测序对扩增产物进行验证,结果表明:禽类组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合。建立了一种检测禽类动物源性成分的PCR方法,该方法检测的灵敏度为0.1%。 相似文献
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为了比较冠状病毒基因相关性,获得特异基因克隆制备冠状病毒基因芯片,根据发布的基因序列,每种病毒设计4~17对引物,利用火鸡冠状病毒(TCV)原毒和蔗糖密度梯度离心纯化浓缩的犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、牛冠状病毒(BCV)细胞毒,提取总RNA并反转录和PCR扩增。回收PCR产物连接pGEM-T-easy载体并转化大肠杆菌TGI,经PCR鉴定后测序。将所有基因片段的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,分别与GenBank有关病毒相关基因片段的核苷酸序列进行分析比较,确定它们的同源性。通过对不同冠状病毒不同基因片段的克隆和测序,发现同一群冠状病毒核苷酸序列间具有较高的同源性。 相似文献
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犬冠状病毒核酸探针的制备及其基因序列的测定与比较 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法扩增犬冠状病毒(CCV)YS1、C11和NL-18株5′端部分S基因序列,以随机插入DNA法对CCV YS1株纯化的PCR产物标记32P同位素,制备核酸探针,并与3株CCV反转录产物杂交.用平端连接法将3株CCV PCR产物克隆于pUC19 Sma I位点或pGEM-T载体中,经PCR鉴定为正确重组质粒.以双脱氧末端终止法测定了重组质粒的cDNA核苷酸序列,并用DNASIS计算机软件进行多重比较分析,绘制系统树.结果表明,所制备的核酸探针可与3株CCV反转录产物杂交,其核苷酸序列与多株CCV相应序列的同源性高达91.9%～99.1%,为CCV的保守区.由此说明,制备的核酸探针可用于犬CCV感染的分子流行病学研究. 相似文献
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采用蔗糖密度梯度离心,纯化浓缩犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的细胞培养物,分别设计7,17,11,10和4对引物,构建了49个基因片段的克隆。煮沸裂解法制备质粒DNA,回收PCR扩增产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,与芯片进行杂交检测,淘汰交叉的克隆片段。结果表明:克隆CCV1,CCV2,CCV5和CCV7可特异诊断CCV,克隆FCV6,FCV7,FCV8和FCV9可特异诊断FCV,克隆FIPV2,FIPV7,FIPV8和FIPV9可特异诊断FIPV,克隆PRCV1,PRCV2和PRCV3可特异诊断PRCV,克隆TGEV3,TGEV4,TGEV5和TGEV6可特异诊断TGEV。将这些特异克隆扩增片段重新点制基因芯片,与病毒PCR产物杂交,未发现交叉现象。基因芯片检测比传统PCR敏感1000倍,可有效应用于这5种动物冠状病毒的检测与区分。 相似文献
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大熊猫犬冠状病毒的分离与鉴定 总被引：11，自引：2，他引：11
以犬肾传代细胞(MDCK)从1只病死大熊猫肝脏中分离到1株病毒,命名为DXMV。电镜观察磷钨酸负染的病毒细胞培养物，发现冠状病毒样粒子，超薄切片上可见细胞浆内病毒包涵体。理化学和生物学鉴定结果表明，DXMV核酸类型为RNA，对氯仿、乙醚敏感，可耐受1％胰蛋白酶的作用，具有一定的耐酸性和耐热性，可在MDCK、FCWF、F81细胞中增殖，无血凝性和血吸附特性。血清中和试验结果表明，DXMV可被犬冠状病毒阳性血清中和。采用犬冠状病毒间接荧光抗体法染色DXMV细胞飞片，可在细胞浆内见到特异性荧光。以冠状病毒通用引物和犬冠状病毒特异性引物，可从大熊猫肝脏和不同代次的病毒细胞培养物中扩增出与预期值251bp和515bp大小相同的核苷酸片段。由此说明，该病毒为犬冠状病毒，大熊猫可被犬冠状病毒感染。 相似文献
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Monospecific antisera were prepared in rabbits against canine coronavirus (CCV) and transmissible gastroenteritis virus of pigs (TGEV), and in 24 pigs and 3 cats against TGEV alone. Neutralizing antibody titres were higher for the immunizing than the heterologous virus, although cross-neutralization usually was detected. This confirmed that CCV and TGEV are distinct, but antigenically related coronaviruses. In sera from 41 dogs, CCV-neutralizing titres were on average 2.7 fold higher than TGEV-neutralizing titres, suggesting that CCV was the causal agent. Sera from 29 cats in colonies with feline infectious peritonitis (FIP) and known to contain TGEV-neutralizing antibody, were found to have titres 12.3 fold higher against CCV. The FIP virus (FIPV) is probably more closely related to CCV than TGEV as judged by antigens involved in virus neutralization.Antisera to two isolates of bovine coronavirus, three isolates of haemagglutinating encephalomyelitis virus, seven strains of avian infectious bronchitis virus and the 229E strain of human coronavirus all failed to neutralize CCV and TGEV. Thus CCV, TGEV and probably FIPV fall into a group of antigenically related agents, separable from other members of the family Coronaviridae, by both virus neutralization and immunofluorescence tests. 相似文献
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