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1.
根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。 相似文献
2.
提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α-干扰素(BoIFN-α)成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为牛α-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛α-干扰素对VSV的抗病毒活性为4.26×105U/mL,对IBRV的抗病毒活性为8.91×104U/mL。结果表明,重组奶牛α-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。 相似文献
3.
用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。 相似文献
4.
鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为获得鸭α-干扰素（DuIFN—α）并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a＋连接后转化到BL21（DE3）获得工程菌BL21（DE3）／pET32a＋DuIFN—α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒（VSV）、鸭瘟强毒（DPV）活性进行研究。结果表明：BL21（DE3）／pET32a＋-DuIFN-α经0．4mmol／LIPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质（Ni—MIAC）进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12800U／mg;利用定量PCR检测到15U／mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN—α的临床应用提供试验数据。 相似文献
5.
为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×106 IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。 相似文献
6.
本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 相似文献
7.
蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测 总被引：1，自引：0，他引：1
应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。 相似文献
8.
猪α干扰素具有抗病毒作用,临床上具有广阔的应用前景.为获得重组猪α干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪α干扰素基因插入供体质粒pFastBac~(TM) Ⅰ多克隆位点,置于pH启动子控制下,在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化.将重组转移栽体质粒转化DH10感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blotting证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达.镍亲和层析柱纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳相对分子质量为19 000.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测其抗病毒活性为9.67×10~4 U/mL.昆虫培养上清及细胞裂解液经2~8稀释在Mare-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒增殖.从而为进一步作为抗病毒药物应用于猪疫病的防治研究奠定了基础. 相似文献
9.
本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。 相似文献
10.
利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。 相似文献
11.
猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素（PoIFN-α）成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素（rPoIFN-α）蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒（VSV）增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×10^4IU/mL（5.2×10^6IU/mg）,在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL（2.3×10^4U/mg）。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。 相似文献
12.
本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。 相似文献
13.
《中国预防兽医学报》2020,(8)
为表达重组鸭γ-干扰素(DuIFNγ),并鉴定其在体内、体外抗病毒活性,本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中登录的DuIFNγ序列进行优化并合成,将其克隆至p ET30a-ELP表达载体中进行重组蛋白诱导表达,并利用类弹性蛋白多肽(ELP)的可逆相变循环特性进行纯化,结果显示,重组蛋白(rELP-DuIFNγ)正确表达,纯化后的rELP-DuIFNγ纯度达90%以上。通过细胞病变抑制法,在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中检测rELP-DuIFNγ体外抗病毒活性,结果显示,rELP-DuIFNγ在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中的抗病毒活性分别为为4.17×10~4U/mg和4.54×10~5U/mg。利用雏鸭感染DHAV-1,同时灌服rELP-DuIFNγ,观察并计算雏鸭发病时间与存活率,初步研究rELP-DuIFNγ的体内抗病毒作用,结果显示r ELP-DuIFNγ在体内可以延缓雏鸭发病时间、降低其发病率。以上结果表明,rELP-DuIFNγ在大肠杆菌中可高效表达,在体内外均具有一定的抗病毒活性。本研究为基因工程DuIFNγ制剂的研制及临床应用奠定了基础。 相似文献
14.
为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID50,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×210 U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。 相似文献
15.
为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。 相似文献
16.
《中国畜牧兽医》2016,(10)
根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
17.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(21)
为了原核表达、纯化犬贾第鞭毛虫α-12贾第素蛋白,试验经RT-PCR获得α-12贾第素基因片段,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组原核表达质粒p ET-28a-α-12,再转化入E.coli Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析验证,并用Ni琼脂糖凝胶纯化融合的α-12贾第素蛋白。结果表明:重组原核表达质粒p ET-28a-α-12经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为40 ku,且主要以包涵体形式存在;表达量约占菌体总蛋白的15.7%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上。 相似文献
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研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性. 相似文献
19.
试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。 相似文献
20.
为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。 相似文献