白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用     

王璐  李秀锦  韩云珍  王幸兴  李振  张峰  潘红丽  仲飞 《兽医大学学报》2012,(11):1634-1639,1644

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒主要抗原蛋白。研究证实由VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为提高VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究在小鼠体内尝试了利用犬白细胞介素2（cIL-2）基因增强VP2DNA疫苗免疫应答的研究。通过RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中分别扩增含终止密码子和不合终止密码子的cIL-2cDNA基因,然后将基因插入到真核表达载体pcDNA3．1中,分别构建成非融合的和与Myc／His融合的clL-2基因真核分泌型表达载体,pcDNA-cIL-2和pcDNA-cIL-2／MH。将pcDNA-oIL-2／MH表达栽体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达栽体能否介导cIL-2在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2表达载体（pcDNA-CD5sp-VP2,本室构建）单注射和VP2／IL-2表达载体共注射对小鼠进行免疫（用pcD-NA3．1栽体作为阴性对照）。免疫后通过ELISA方法检测免疫后不同时期小鼠血清VP2的抗体水平,并通过细胞增殖试验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。试验结果表明,扩增的小鼠cIL-2基因与GenBank的参考序列一致,构建的cIL-2表达载体能够介导重组cIL-2在HEK293T细胞中进行分泌表达。免疫结果显示,利用cIL-2／VP2表达载体共免疫小鼠,免疫后35d血清中VP2的抗体水平达到1：5120,明显高于VP2表达载体单免疫组（P〈0．01）。淋巴细胞增殖试验表明,2组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于阴性对照组（P〈0．01）,共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组（P〈0．05）。共免疫小鼠淋巴细胞7干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组（P〈0．01）。由此可见,cIL-2表达载体可明显提高CPVVP2基因疫苗的免疫应答水平。  相似文献   

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用     

贾启恒  温洁霞  王利月  林洪羽  张峰  王璐  孙岩  李秀锦  仲飞 《中国兽医学报》2013,33(5)

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.  相似文献   

寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选     

《中国兽医学报》2019,(6):1135-1139

选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。  相似文献   

小鹅瘟病毒VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果   总被引：1，自引：0，他引：1  

许洪洁  张鑫  夏铭琦  胡桂学 《中国兽药杂志》2008,42(1):5-8

检测小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果。大量提取本实验室已构建的含有GPVVP3基因的真核表达质粒pVAXI／VP3和空载体pVAXI,分两组进行两点肌肉注射免疫小鼠,共免疫4次。利用MTY法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,间接ELISA法检测免疫小鼠血清中GPV特异性抗体的水平。淋巴细胞增殖指数,免疫小鼠与正常小鼠差异不显著。间接ELISA检测结果表明,pVAXI／VP3质粒免疫组小鼠血清中GPV特异性抗体水平,显著高于空载体对照组和阴性对照组。已构建的GPVVP3基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫,为小鹅瘟核酸疫苗的研究奠定基础。  相似文献   

融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗的构建及其免疫应答   总被引：1，自引：0，他引：1  

陈关平  吴涛  黄勤锋  陈焕春 《中国兽医学报》2009,29(8)

用小鼠模型评价融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗和不同免疫策略的免疫应答.用PCR方法扩增牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因,分别克隆到pMD18-T载体并测序验证正确后将其克隆到质粒pcDNA的相应位点获得质粒pcDNA-VP22-P12A3C.然后将BALB/c小鼠分成7组进行免疫.结果表明,DNA疫苗pcDNA-VP22-P12A3C诱导的细胞免疫水平超过了灭活疫苗,DNA疫苗与灭活疫苗联合免疫组体液免疫水平接近灭活疫苗组而细胞免疫水平远高于灭活疫苗组,为进一步研究VP22和P12A3C融合表达的基因工程疫苗奠定了基础.  相似文献   

猪IL-2对pcDNA—E39．VP2真核共表达质粒免疫原性的影响     

肖义蓉  王印  郭万柱  徐志文  朱玲  杨泽晓  王小玉  李云云 《兽医大学学报》2011,(7):937-941

为了研究猪IL-2基因的真核质粒和融合基因形式对pcDNA—E39．VP2真核共表达质粒的免疫增强作用,分别将IL-2基因插入pcDNA3．1（＋）和pcDNA—E39．VP2（已构建）中构建重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-E39．VP2。将真核质粒pcDNA-IL2-E39．VP2免疫小鼠,另外,将pcDNA—IL2分别先于和后于pcDNA-E39．VP23d免疫小鼠,同时设pcDNA-E39．VP2对照组。对免疫小鼠进行PPV（JEV）抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖功能和外周血T淋巴细胞亚群变化的检测。结果显示,1周后,pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组和pcDNA—IL2后于pcDNA—E39．VP注射的免疫组JEV／PPV抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖活性显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）高于对照组,pcDNA-IL2先于pcDNA—E39．VP注射的免疫组仅在第5周显著（P〈0．05）高于对照组;各组（除对照组外）CD8^＋值差异不显著（P〉0．05）,CD4^＋、CD4／cD8值都高于对照组,其中pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组与对照组差异极显著（P〈0．01）。结果表明,IL-2能增强pcDNA-E39．VP诱导小鼠的免疫能力,且以融合基因形式构建的真核质粒免疫增强效果最明显。  相似文献   

兔出血症病毒VP60基因真核表达质粒的构建及初步评价   总被引：1，自引：0，他引：1  

原冬伟  刘家森  郭东春  司昌德  姜骞  林欢  穆亚芳  刘行波  曲连东 《中国兽医学报》2011,31(11)

利用pMD18-T-VP60质粒（包含RHDVTP株VP60基因）PCR扩增并酶切回收VP60基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建真核表达质粒pcDNA—VP60,对重组质粒进行酶切和PCR鉴定;将重组质粒转染RK13细胞,进行间接免疫荧光和Western-blot检测;将构建好的重组质粒作为核酸疫苗,腿部肌肉注射免疫小鼠,采用间接ELISA法检测抗体水平;采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞术（FACS）检测细胞免疫情况;采用PCR方法检测重组质粒在小鼠体内的生物安全性。结果显示,成功构建pcDNA—VP60真核表达质粒,并在RK13细胞中获得表达。重组质粒作为核酸疫苗能够诱导小鼠体内产生特异性抗体而且抗体水平随免疫次数增加而逐渐增高,在免疫后49d时达到峰值;脾淋巴细胞刺激指数和CD4＋、CD8＋淋巴细胞亚群数量百分率明显增高,且与对照组存在明显差异。经PCR鉴定VP60基因未整合到小鼠主要脏器染色体上。结果表明,构建的pcDNA—VP60真核表达质粒能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,重组质粒对小鼠是安全的。  相似文献   

IL-2和绵羊梅迪-维斯纳病病毒核心蛋白Gag核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答     

丁忠庆  沈荣显  相文华  赵丽荣  赵立平 《中国预防兽医学报》2007,29(3):204-207

构建绵羊梅迪-维斯纳病病毒（MVV）核心蛋白Gag核酸疫苗并与IL．2联合免疫小鼠，为评价其诱导的体液和细胞免疫应答。将MVVgag基因与羊IL-2基因分别插入到核酸疫苗载体质粒pcDNA5．0中，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5.0-IL-2，并经酶切以及测序鉴定。分别用阳性质粒pcDNA5．0-Gag、空载体pcDNA5．0及pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2共免疫BALB／C小鼠，采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体以及IFN-γ和IL-4水平，用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖。结果表明pcDNA5．0-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IFN-γ、IL-4水平高于pcDNA5．0-Gag免疫组，与空载体pcDNA5．0对照组相比有显著差异（P〈0．01）。且pcDNA5．0-Gag单独免疫组及与IL-2联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数均高于空载体pcDNA5．0对照组。因此，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2，用其联合免疫BALB／C小鼠所诱导的免疫反应以特异性细胞免疫应答为主，同时可产生体液免疫，且IL-2发挥了免疫佐剂的作用，为进一步将其用于MVV的防治奠定了基础。  相似文献   

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究     

闫宗斌  伍生军  杨静  闫可心  相思宇  许应天  薛书江  柴方红 《中国畜牧兽医》2020,47(7):2231-2238

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白（命名为rMseno）对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。  相似文献   

共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价   总被引：1，自引：0，他引：1  

丁轲  余祖华  李旺  闫文朝  王臣  赵战勤  程相朝  张春杰  王天奇  程安春  汪铭书 《畜牧兽医学报》2013,(2):262-269

笔者拟构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3和鹅白细胞介素-2(IL-2)的分泌性重组乳酸杆菌,评价口服表达融合蛋白GPV VP3-gIL2的重组乳酸杆菌的免疫效果。通过酶切将VP3基因和IL-2基因连接,并在其5′端连入乳酸杆菌的信号肽基因SP,亚克隆到乳酸杆菌整合表达载体pMJ67,电转化入干酪乳杆菌L.CECT5276,SDS-PAGE和Western blot法鉴定重组菌GPVVP3-gIL2融合蛋白的表达活性。将重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅后检测血清GPV抗体、小肠黏液sIgA和脾淋巴细胞增殖情况,评价其免疫效果。结果表明,酶切和测序结果表明成功构建重组表达载体pMJ-SP-GPVVP3-gIL2,PCR证实质粒pMJ-SP-GPVVP3-gIL2成功整合到乳酸杆菌基因组;Western blot表明重组乳酸杆菌分泌表达的融合蛋白GPVVP3-gIL2能与GPV阳性血清特异性结合;淋巴细胞增殖试验表明口服重组菌后能特异地刺激脾淋巴细胞增殖,且在第4、5、6周明显高于GPV VP3组和gIL2组;重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅可以产生抗VP3蛋白抗体,且具有中和活性的抗体显著高于GPV VP3组;小肠黏液sIgA细胞生成的数量自第2周较GPV VP3组和疫苗组显著上升。动物攻毒试验结果显示GPV VP3-gIL2融合蛋白免疫组能够获得85%的保护率,表明所构建的重组乳酸杆菌口服后对GPV的攻击具有较好的免疫保护作用。本试验成功构建能稳定表达GPV VP3-IL2融合蛋白的口服乳酸杆菌工程菌,为研究其作为口服疫苗奠定了基础。  相似文献   

Immunogenicity of a DNA-launched replicon-based canine parvovirus DNA vaccine expressing VP2 antigen in dogs     

Dahiya SS  Saini M  Kumar P  Gupta PK 《Research in veterinary science》2012,93(2):1089-1097

  相似文献   

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化     

张坤  马丽娟  李刚  黄伟  李伟  贾凤琴 《中国动物保健》2009,11(12):46-51

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。  相似文献   

Construction of Specifically Targeted Chimeric Canine Parvovirus DNA Vaccine and Its Efficacy Assessment     

WU Zhi  HAO Fu-xing  WANG Yong-juan  LIU Yang  WANG Dong  XU Zhou  YUAN Wei-feng 《中国畜牧兽医》2016,43(10):2768-2774

To design chimeric DNA vaccine targeted to antigen-presenting cells with enhanced efficacy to induce immunization.The plasmid containing the gene encoding the extracelluar domain of canine cytotoxic T-lymphocyte antigen 4(CTLA-4₁₂₅),was directly fused to the gene fragment for major antigenic epitopes of VP2(VP2₂₂₈) by molecular engineering technology.The plasmid containing VP2₂₂₈ alone was also constructed to serve as control and transfection of COS-7 cells with the two resultant plasimds was performed respectively,followed by assay of Western blotting.The mice were immunized with the constructed two plasimds,respectively.After immunization,the antibodies anginst CPV in the immunized mice at different times were measured by HI.The spleen lymphocyte proliferation response was determined by lymphocyte proliferation assay,and the interferon-γ (IFN-γ) expression level of the mouse lymphocytes were measured by ELISA.The eukaryotic expression plasimds of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ fusion protein or VP2₂₂₈ alone were cloned.Western blotting showed that the two recombinant proteins could be expressed.Immunization results showed that the antibody levels in serum of CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05).The lymphocyte stimulation indexes and secreted IFN-γ levels of the CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈-immunized mice were significantly higher than that of VP2₂₂₈-immunized mice (P<0.05 and P<0.01),respectively.CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈ chimeric DNA vaccine stimulates strong immune response in mice,making it possible for further exploration into chimeric DNA that target the antigen to APCs.  相似文献   

特异性靶向犬细小病毒融合DNA疫苗的构建及免疫效果的研究     

吴植  郝福星  王永娟  刘洋  王栋  徐州  袁维峰 《中国畜牧兽医》2016,43(10):2768-2774

研究旨在构建特异性靶向犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）融合DNA疫苗,探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。试验用重组技术构建了含细胞毒性T淋巴细胞抗原-4胞外区（CTLA-4₁₂₅）与犬细小病毒VP2的主要抗原表位区域（VP2₂₂₈）融合表达质粒pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈,同时构建了不含CTLA-4₁₂₅的pVAX1-VP2₂₂₈,体外转染COS-7细胞,Western blotting检测其表达产物;将pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈、pVAX1-VP2₂₂₈分别免疫小鼠,免疫后进行抗体水平测定和抗体亚型分析;通过淋巴细胞增殖试验和ELISA分别检测淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平。结果显示成功构建了pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈和pVAX1-VP2₂₂₈,并能在COS-7细胞中正确表达;抗体检测结果显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组抗体水平显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.05）;淋巴细胞增殖试验显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组的刺激指数显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.05）;γ-干扰素表达水平测定显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组极显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.01）。结果表明,CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈融合DNA能有效增强动物对VP2₂₂₈抗原的免疫应答,为进一步研究融合DNA疫苗特异性的靶向递呈机制奠定基础。  相似文献   

虎源FPV主要抗原表位区基因的原核表达及免疫原性分析     

杨莹莹  田丽红  曾祥伟 《经济动物学报》2014,(1):24-28

为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。  相似文献   

犬细小病毒VP2抗体竞争ELISA检测方法的初步建立   总被引：3，自引：3，他引：0  

赵丹  贾红  侯绍华  袁维峰  郭晓宇  柏丽华  仆仕金  朱鸿飞 《中国畜牧兽医》2012,39(4):11-16

本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2抗体,并建立竞争ELISA检测方法,从而为CPV疫苗免疫效果的检测及血清学调查提供技术支持。参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计1对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,PCR扩增VP2基因全长序列,将其克隆到pET28a(＋)载体中,构建原核表达载体pET28a-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,目的蛋白分子质量大小为67 ku,可被CPV抗血清识别,证明其能与特异性抗体结合,有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫家兔制备VP2多抗,采用辣根过氧化物酶进行标记,初步建立了竞争ELISA方法。结果显示,VP2重组蛋白的最佳包被浓度为5 μg/mL,酶标多抗的最佳稀释度为1∶3200,封闭条件为4 ℃过夜,最适的封闭液为10%小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作浓度为1∶5000,显色时间为25 min。竞争ELISA试验结果表明,该方法具有较强的稳定性,有望为CPV疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段。  相似文献   

抗酵母表达犬细小病毒蛋白VP2的单克隆抗体的制备和鉴定     

贺英  史秋梅  潘素敏  张艳英  邵新华 《兽医大学学报》2012,(11):1629-1633

以纯化的酵母重组表达的犬细小病毒VP2单位免疫BALB／C小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA方法筛选,获得4株能稳定分泌抗犬细小病毒CPV结构蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体中,2株属于IgG2b亚类,2株属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1：51200和1：204800,细胞培养上清液效价可达1：256、1：512。ELISA分析表明,这些单抗仅与CPV及其VP2发生特异性反应,而与CDV和CAV-1及CAV-2没有交叉反应;荧光免疫染色病毒检测进一步表明单克隆抗体的特异性效果好。这些特异性单抗的制备为建立有效的检测犬细小病毒感染奠定了基础。  相似文献   

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性     

向敏  张洁  高其双  卢顺  陈志华  黄海军  陶弼菲  彭霞  占才耀  夏瑜  童伟文  华娟  王连芳 《兽医大学学报》2013,(11):1627-1630

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。  相似文献