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1.
应用RT-PCR方法从麻鸡副黏病毒ZH-1株中扩增F基因并克隆入pGEM○R-T载体,经序列测定、分析,结果显示ZH-1株F基因与NDV国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,pCI-F体外转染Vero细胞,能在Vero细胞中表达,利用pCI-F质粒进行动物试验,结果表明雏鸡免疫14 d后在体内可检测到特异性抗体,pCI-F质粒二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%,这一结果提示利用F基因构建的核酸疫苗具有重要的开发前景。 相似文献
2.
应用RT-PCR方法从麻鸡副黏病毒ZH-1株中扩增HN基因并克隆人pGEM-T载体,经序列测定、分析,结果显示ZH-1株HN基因与NDV国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到92％.将HN基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-HN,转染Vero细胞,能在Vero细胞中表达,利用pCI-HN质粒进行动物试验,结果表明,雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pCI-HN质粒二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为67％,这一结果提示,利用HN基因构建的核酸疫苗具有重要的开发应用价值. 相似文献
3.
《畜牧与兽医》2021,(3)
为构建鸭疫里氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因真核表达重组质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和对雏鸭的免疫保护效果,以pVAX1为真核表达载体,构建真核表达质粒pVAX1-OmpA,通过质粒PCR、双酶切和测序进行鉴定,将鉴定后的阳性质粒pVAX1-OmpA转染至DF-1细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot方法检测OmpA基因在DF-1细胞中的表达;将pVAX1-OmpA DNA免疫雏鸭,采集血清检测免疫抗体,并进行攻毒保护试验。结果,成功构建真核表达质粒pVAX1-OmpA,两种免疫学方法均检测到ompA蛋白的特异性表达,免疫雏鸭后14、28、35、49、63 d抗体水平与灭活疫苗组差异不显著,对雏鸭的免疫保护率达到100%。结果表明,pVAX1-OmpA重组质粒免疫雏鸭后能够诱导产生特异性的免疫抗体,能够产生较强的免疫保护效果,可作为新型DNA疫苗的候选。 相似文献
4.
将新城疫病毒（NDV）F48E9株的F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,筛选出含有F和HN基因的重组质粒,命名为pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化的质粒转染Vero细胞后,经间接免疫荧光试验检测到蛋白的表达。pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒共转染Vero细胞后,观察到明显的细胞融合现象。结果表明NDV F48E9株的F和HN蛋白在真核细胞内得到了真实的表达,并且表达产物具有天然蛋白活性。 相似文献
5.
新城疫病毒F基因的真核表达及其免疫原性检测 总被引：3，自引：0，他引：3
为了探讨F基因在DNA免疫防制新城疫(ND)中的免疫原性,将NDV Z株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-H is-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNA NDV ZF。在脂质体作用下将pcDNA NDV ZF转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量F蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果证明,pcDNA NDV ZF基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。 相似文献
6.
应用RT-PCR方法从鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株中扩增出VP2基因,并克隆入T-easy载体。序列测定分析结果表明IBDVJS株的VP2基因与国际标准强毒株的核苷酸序列同源性达98%,氨基酸序列同源性达99%以上。随后将VP2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/zeo( ),构建成功真核表达质粒pcD-VP2,pcD-VP2体外转染COS-1细胞,能在COS-1细胞中表达。利用pcD-VP2质粒进行动物实验,结果表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pcD-VP2的真核表达质粒二次免疫诱导鸡产生对IBDV强毒攻击的保护率为67%,这一结果提示VP2基因具有重要开发应用价值。 相似文献
7.
为了研究Raf激酶抑制蛋白（RKIP）对新城疫病毒（NDV）复制的影响,从鸡胚成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增RKIP基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR、双酶切和测序鉴定,采用Fu-GENEHD法将阳性质粒转染Vero细胞,经G418筛选,有限稀释法获取单克隆细胞株,Western-blotting检测RKIP的表达。利用Real-time PCR测定病毒感染细胞后培养上清的病毒量。结果表明：成功构建鸡RKIP真核表达质粒;转染Vero细胞后经克隆化培养获得稳定表达鸡RKIP的细胞株Vero-RKIP;感染初期,NDV在Vero-RKIP上表现出了更强的复制能力。 相似文献
8.
犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。 相似文献
9.
用RT PCR 方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )上,得到重组质粒pcDNA VP1。根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1 基因的主要抗原位点141 位~160 位及200 位~213位的氨基酸序列,将F 片段克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )中,得到重组质粒pcDNA F。在脂质体介导下,重组质粒pcD NA VP1和pcDNA F转染Vero细胞。间接免疫荧光分析表明VP1 基因和F 基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础。 相似文献
10.
本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。 相似文献
12.
为全面了解广西分离株GX19／2011的生物学和遗传特性,对分离株的鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）、6周龄鸡胚静脉接种致病指数（IVPI）和对鸭的致病力进行测定,并对其全基因遗传特性进行研究研究。结果显示：该分离株的ELD50为10-9.48/0．1mL、MDT为51．4h、ICPI为1．80、IVPI为2．82。使用该毒株分别感染35日龄和50日龄的鸭,发病率均为100％,死亡率分别为100％,70％。该毒株全长为15192bp,与F48E8和GD09-2等参考毒株的亲缘关系较近,均属于基因IX型。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为11R-R-Q-R-R-F117,具有强毒株的典型特征。生物学特性和遗传进化分析结果都表明该毒株为速发型强毒株,同时对鸭具有较强的致病力。 相似文献
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利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%. 相似文献
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本研究以中国斗鸡λ噬菌体cDNA文库为模板,克隆了DJ-1基因,并构建了pGEX-4T-1-DJ-1原核表达载体和pEGFP-N3-DJ-1真核表达载体,前者用来研究DJ-1蛋白在大肠杆菌表达系统中的优化表达;后者用来转染成纤维细胞系,研究DJ-1蛋白的亚细胞定位和建立转DJ-1基因的细胞模型。试验成功克隆了DJ-1基因的CDS区,并将其定向插入到pGEX-4T-1原核表达载体和pEGFP-N3真核表达载体中。IPTG浓度梯度诱导原核表达结果显示,在0.8 mmol/L时DJ-1蛋白表达量最高;时间梯度结果显示,在8 h时DJ-1蛋白表达量最高;真核表达载体转染脂尾羊成纤维细胞后48 h阳性率最高,DJ-1蛋白在细胞核和胞质中均有表达,但胞质中居多。上述结果表明,本试验已经建立了稳定的DJ-1蛋白的真核、原核优化的表达系统,为进一步研究DJ-1基因的功能奠定了基础。 相似文献
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为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。 相似文献
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根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆 相似文献
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为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献