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禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达 总被引：9，自引：0，他引：9
根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。 相似文献
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对所分离鉴定的猪圆环病毒2型(PCV-2)ZZ株,参照GenBank中PCV-2全基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR扩增出PCV-2ORF2片段,原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET-ORF2,IPTG进行诱导表述,并进行Western blot分析。结果表明,PCR扩增产物长度为702bp,大小与预期的一致,成功构建重组质粒,经IPTG诱导成功获得分子质量约为30ku的表达蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性,为进一步研制PCV-2疫苗提供依据。 相似文献
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伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物. 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(9):67-70
根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。 相似文献
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通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础 相似文献
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根据伪狂犬病病毒 Rise毒株 g E基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用 PCR方法 ,从伪狂犬病病毒闽 A株 DNA扩增出 5 5 8bp片段。将该片段克隆到 p UC19质粒中 ,测序正确后再将其克隆到表达质粒 p ET- 2 8a中 ,以 BL 2 1(DE3)为宿主菌 ,在 IPTG诱导下获得了高效表达。经 SDS- PAGE及 Western- blotting鉴定分析 ,表达蛋白大小约 2 30 0 0 ,蛋白薄层扫描分析表明 ,该蛋白约占菌体总蛋白的 30 %。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
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以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。 相似文献
11.
根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。 相似文献
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以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。 相似文献
13.
应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础． 相似文献
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为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。 相似文献
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对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。 相似文献
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为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋），并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点，构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），优化诱导条件，使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明，V13KL基因成功克隆并且获得表达，在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。 相似文献
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病毒蛋白VP2是兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV）的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗VP2的抗血清。对制备的抗VP2抗血清进行特异性分析,再利用该抗体对转染pEGFP-VP2的BHK-21细胞进行检测,以研究VP2蛋白在细胞内的定位情况。结果表明,pEGFP-VP2转染BHK-21细胞后,不仅VP2蛋白得到了成功表达,而且通过检测偶联的绿色荧光蛋白可判断出VP2蛋白主要分布于BHK-21细胞的细胞质。本研究成功构建了VP2与绿色荧光蛋白融合的表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现VP2主要在细胞质内表达并分布,为深入探讨VP2的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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目前广泛应用的各类胶原及胶原蛋白多为人工提取的方法获得,为了得到高纯度原核表达的胶原蛋白,本研究构建了血吸虫V型胶原蛋白（Schistosoma japonicum type V collagen,Sj Col V）（a1）基因AY815998.1的原核表达质粒,并对其进行了原核表达。结果表明SjColV（a1）蛋白能在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中高效表达,但原核表达的融合蛋白不够稳定,且存在形式多样。本文就其表达情况进行了分析,并纯化得到原核表达的全长rSjColV（a1）,用V型胶原蛋白的单抗对其进行鉴定,同时分析其在？80℃保存的稳定性,研究结果为SjColV（a1）的深入研究和利用提供了一定的理论依据。 相似文献