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应用EMBOSS的CHIPS和CUSP程序对禽呼肠病毒(ARV)3个编码蛋白的基因密码子偏爱性进行分析,其结果与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较.结果显示,ARVσC、ARVσB和ARVσNS的Nc(Effective number of condons)值为56.689、56.457和51.532.3种蛋白的部分编码密码子使用频率有较大的差异,其与大肠埃希菌、酵母及人的密码子偏爱性也有不同,表明ARVσC和ARVσNS的密码子与原核生物及人的相差较大,其表达系统选择在酵母较为合适,而ARVσB的密码子与原核生物较近,其表达系统选择在大肠埃希菌较为合适. 相似文献
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伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物. 相似文献
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根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性. 相似文献
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桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因(cp)序列中含有较多大肠埃希菌(Escherichia mori)BL21(DE3)的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显著提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。 相似文献
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细菌外膜成分布劳恩脂蛋白(Braun lipoprotein,BLP)在调控大肠埃希氏菌感染导致的宿主炎症反应过程中发挥的具体作用尚不清楚。该研究分析了野生型大肠埃希氏菌(BLP表达阳性)、大肠埃希氏菌JE5505(BLP表达阴性)和大肠埃希氏菌JE5505与BLP联合刺激小鼠后,体内促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)、抗炎因子(IL-10)和趋化因子(RANTES)分泌的情况,以及小鼠的存活率和脏器的损伤水平。结果表明,大肠埃希氏菌JE5505组感染小鼠后导致死亡的速度比野生型大肠埃希氏菌组和大肠埃希氏菌JE5505与BLP联合刺激组更迅速;JE5505与BLP联合刺激组在感染20 h后小鼠不再出现死亡。在大肠埃希氏菌JE5505感染的小鼠血清、肝脏和肺脏中,促炎性细胞因子和趋化因子的分泌水平显著高于、抗炎细胞因子显著低于野生型大肠埃希氏菌组和大肠埃希氏菌JE5505与BLP联合刺激组的小鼠(P<0.01)。此外,BLP的存在可下调大肠埃希氏菌感染导致小鼠脏器中组织损伤标志物HMGB1和HABP2的蛋白表达(P<0.05)。说明细菌外膜成分BLP耐受可能通过调节炎症介质的产生,进而对细菌感染导致宿主脏器损伤和炎症反应发挥调控和保护作用,从而避免小鼠在被大肠埃希氏菌感染后出现快速死亡的现象。 相似文献
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应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。 相似文献
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犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。 相似文献
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沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用 总被引：3，自引：2，他引：1
根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测. 相似文献
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山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测. 相似文献
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可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中. 相似文献
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口蹄疫病毒(FMDV)的2C蛋白中存在对自然感染和灭活疫苗免疫动物具有鉴别诊断意义的抗原表位。为建立一种敏感的血清学鉴别诊断方法,本研究截取FMDV 2C蛋白的C端B细胞表位较为富集的区域与全长3AB基因组合,经原核表达获得分子量约为44 ku的目的蛋白。Western blot分析表明,表达产物2C3AB与FMDV感染动物的阳性血清呈特异性反应。以纯化的目的蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,敏感性检测表明该方法比3ABC-ELISA具有更高的敏感性;同时检测猪圆环病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒标准阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复性试验显示,OD450nm值的变异系数小于9%。采用该方法检测不同背景的临床样品,并与3ABC-ELISA及进口试剂盒比较,总符合率分别为98.5%和90%。结果表明,该ELISA检测方法具有更高的敏感性和良好的特异性、重复性。 相似文献
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对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。 相似文献
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乙脑病毒非结构蛋白NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立 总被引：1，自引：0，他引：1
克隆表达乙脑病毒非结构蛋白NS1,并以其作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法。用此方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪圆环病毒(PCV)阳性血清各3份,以及33份健康非免疫仔猪血清和205份乙型脑炎灭活疫苗免疫的猪血清,评价NS1-ELISA方法的特异性。取54份乙脑病毒感染的猪血清进行NS1-ELISA检测,评价该方法的敏感性。NS1-ELISA检测的特异性为95%,敏感性达90.7%。与商品化试剂盒比较,其符合率达到96.0%。在重复性试验中,NS1-ELISA检测方法重复性较好。本试验为进一步研究不同感染时期NS1抗体水平的差异奠定基础。 相似文献
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基于重组猪囊虫18 ku抗原的间接ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从猪囊尾蚴中克隆到18 ku蛋白基因,将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接后测序分析.将目的基因亚克隆至表达载体,构建重组质粒pGEX-CE18,经转化大肠杆菌BL21 (DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物.表达的目的蛋白纯化后作抗原建立检测猪囊虫抗体的重组蛋白间接ELISA方法.结果表明,18 ku蛋白基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物约为35 ku的融合蛋白,并能被猪囊虫感染血清识别.经薄层扫描分析,表达量占菌体蛋白总量的28%.与商品化ELISA试剂盒平行检测178份阳性血清样品,二者的符合率为98.83%,说明建立的重组蛋白ELISA方法可用于猪囊虫病的诊断. 相似文献
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为建立鸡毒支原体(MG)种特异性检测的间接ELISA检测方法,本研究以原核表达的PvpA蛋白作为包被抗原,初步建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法.特异性试验结果表明,重组PvpA蛋白与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、滑液支原体、大肠杆菌“O”抗原、禽沙门氏茵“O”抗原阳性血清均不发生交叉反应.该方法的批内变异系数小于8％,批间变异系数小于11％,表明具有较好的重复性.采用该检测方法与进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行检测比较,两者阳性和阴性符合率均达到90％以上.本研究建立的间接ELISA检测方法为MG抗体检测试剂盒的研制奠定了基础. 相似文献
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RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。 相似文献
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为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了B.melitensisM5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白.经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25 ku,具有较好的抗原性.以纯化的virB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份B.melitensis临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于B.melitensis感染的血清检测,为进一步建立B.melitensisM5-90 virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法. 相似文献
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根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶（LDH）基因序列设计1对引物，PCR扩增LDH基因，首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上，然后连接到表达载体pGEX—KG上，经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在。将超声波破碎的诱导菌液高速离心，其上清用Glutathione Sepharose4Bbead亲和层析纯化。用猪肺炎支原体的标准阳性血清对纯化蛋白作Western—blot检测，出现目的条带；以纯化蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，较高的特异性与敏感性。用建立的ELISA方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试荆盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为92．5％。用建立的ELISA方法检测了671份临床送检不同年龄阶段的猪血清，结果显示断奶前仔猪猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopnenmoniae，MHP）感染率为44．3％，保育猪为3．0％，育肥猪为17．44％，种猪为73．41％，这初步反映了猪喘气病在各个年龄阶段的感染率。 相似文献