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1.
发酵乳酸杆菌F6对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR）检测益生性发酵乳酸杆菌F6刺激鸡小肠上皮细胞后抗菌肽β-防御素-9（AvBD9）基因表达变化,为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系的新角度解析益生菌发挥益生作用的新途径和机制提供一定的基础及依据。利用不同剂量（2×105,2×106,2×107 CFU）的发酵乳酸杆菌F6分别刺激原代培养的鸡小肠上皮细胞4h,提取刺激后的细胞总RNA,反转录为cDNA,FQ-PCR检测抗菌肽AvBD9基因表达变化。结果表明,未受刺激的正常对照组也检测到AvBD9mRNA的表达,发酵乳酸杆菌F6能上调AvBD9基因表达。刺激组中AvBD9mRNA的表达在不同剂量组之间存在差异。2×105 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量极显著高于未受细菌刺激的对照组和2×106 CFU/mL组（P〈0.01）,显著高于2×107 CFU/mL组（P〈0.05）。2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量显著高于未受细菌刺激的对照组（P〈0.05）,但2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组之间无显著差异（P〉0.05）。发酵乳杆菌F6与鸡小肠上皮细胞相互作用过程中可提高抗菌肽AvBD9mRNA的表达,且存在剂量依赖性。 相似文献
2.
重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定 总被引：6，自引：1，他引：5
鸡抗菌肽属β-防御素类,在鸡的先天性免疫中发挥重要作用.本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因(AvBD10).亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10.将重组质粒转化至BL21,于37℃用IPTG诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.3%.表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约为31 ku.重组蛋白经纯化后,以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性.结果显示.重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性.此外,重组鸡AvBD10蛋白在70℃～100℃及在pH4～pH10条件下仍具有抗菌活性. 相似文献
3.
重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因.经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204 bp,编码68个氨基酸残基.根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树.发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%.将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达.SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32 ku.对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定.结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性.重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250 μg/mL.此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性. 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(4):604-612
为了解不同乳酸杆菌的刺激对绵羊瘤胃上皮细胞中绵羊β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)的可能调节作用,本研究选用了2株具有益生作用的乳酸杆菌,即干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)和植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8),首先,运用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)检测与乳酸杆菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1mRNA的相对表达量;其次,探讨了2株乳酸杆菌诱导SBD-1 mRNA表达的差异性,选取优势菌株;最后,运用RTq PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法,检测优势菌株活菌、灭活菌及其培养上清液对SBD-1基因及蛋白水平表达的影响。结果表明:2株乳酸杆菌均能促进SBD-1 mRNA的相对表达量,乳酸杆菌的浓度为107CFU/m L、刺激细胞8 h时能极显著促进SBD-1 mRNA的相对表达量(P0.01),而L.plantarum P-8强于L.casei Zhang;进一步的研究表明L.plantarum P-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的基因及蛋白表达(P0.05),但弱于活菌。本研究结果表明L.plantarum P-8和L.casei Zhang均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达。 相似文献
5.
鸡抗菌肽属β-防御素类，在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因（AvBD10）亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21，于37℃用IPTG诱导培养不同时间，SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34．3％。表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在，分子量约为31ku。重组蛋白经纯化后，以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌，利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性。结果显示，重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性。此外，重组鸡AvBD10蛋白在-70℃～100℃及在pH4-pH10条件下仍具有抗茵活性。 相似文献
6.
《养殖与饲料．饲料世界》2020,(8)
选用不同浓度的丁酸钠对体外培养的IPEC-J2进行刺激试验,利用实时荧光定量PCR从m RNA水平分别研究不同浓度丁酸钠刺激猪小肠上皮细胞后pBD1、pBD2、pBD3基因表达水平的差异,以期研究丁酸钠对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)β-防御素(p BD)表达的调节作用。试验结果表明,丁酸钠对pBD1、pBD2、pBD3基因调控作用存在差异,丁酸钠对pBD3基因调控最为显著,不同浓度丁酸钠均能上调pBD3 mRNA的表达,并呈现一定的剂量依赖性。 相似文献
7.
《中国兽医杂志》2017,(7)
为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1,SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,然后利用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)研究接受刺激后瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA表达的差异。结果表明,在各时间组内,SBD-1 mRNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU/m L时表达量均达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P﹤0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 mRNA的表达量先是随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势,诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P﹤0.01)。本试验结果表明,酿酒酵母菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1的表达量达到最高。 相似文献
8.
为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。 相似文献
9.
《畜牧兽医学报》2015,(5)
选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。 相似文献
10.
为了探讨鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus, GG)对鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)感染的防御作用,本实验拟利用鼠伤寒沙门菌诱导建立小鼠肠炎模型,采用鼠李糖乳杆菌对肠炎模型进行干预。通过检测小鼠的肠道病理变化、器官指数、沙门菌的组织荷菌数、盲肠组织细胞因子的表达分泌水平及小鼠体重和存活率,明确鼠李糖乳杆菌对沙门菌感染小鼠的保护作用。结果显示鼠李糖乳杆菌能显著改善沙门菌造成的肠炎损伤,抑制沙门菌向脾、肝脏等器官的转移及分布,促进抑炎因子IL-10的分泌、抑制炎性因子NO、IL-12的分泌从而缓解肠道炎症,并能提高感染沙门菌后小鼠的体重和存活率。表明鼠李糖乳杆菌在防御沙门菌感染及改善肠道损伤方面发挥了较好的保护作用。 相似文献
11.
12.
三株乳酸杆菌的分离鉴定与益生特性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究通过分离鉴定猪肠道内乳酸杆菌并对其益生特性进行比较分析,旨在为乳酸杆菌在仔猪饲粮中的应用提供科学依据。试验选取健康猪粪便,利用选择性培养基进行厌氧培养和单克隆纯化,共获得三株乳酸杆菌,通过生化鉴定、16Sr RNA基因序列测定和同源性分析,确定分离菌株分别为植物乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌;采用牛津杯法、活菌计数法和细胞试验等研究三株乳酸杆菌体外抑菌活性、黏附性及竞争性黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的益生特性。结果表明:与对照组相比,三株乳酸杆菌培养上清液的抑菌圈直径(P0.01)和抑菌效果(P0.01)差异均极显著,并且以植物乳杆菌培养上清液的抗菌效果为最佳;三株乳酸杆菌均可黏附于IPEC-J2细胞,并且以植物乳杆菌黏附IPEC-J2的菌数为最多;与对照组相比,三株乳酸杆菌对大肠杆菌黏附IPEC-J2细胞均具有抑制作用(P0.01),并且以植物乳杆菌抑制黏附的效果最好。 相似文献
13.
鸡肠道内乳酸菌的分离鉴定及体外抑菌试验 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国动物检疫》2017,(1)
为获得鸡肠道内抑菌效果好、适应性强的乳酸菌,从健康鸡小肠内容物中分离乳酸杆菌,并对其进行生化鉴定。结果成功从鸡小肠中分离出6株细菌。通过革兰氏染色和生化鉴定,发现这6株细菌分别是微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)。对分离到的6株乳酸菌进行体外抑菌试验,结果表明肠乳杆菌(L.intestinalis)对大肠杆菌有一定的抑菌作用。该研究为后期开发益生菌制剂奠定了一定的基础。 相似文献
14.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为构建表达禽β-防御素6(AvBD6)的重组乳酸菌并检测重组蛋白AvBD6(rAvBD6)的免疫调节活性,本研究根据GenBank AvBD6的参考序列,经过密码子优化后合成了AvBD6:AvBD6(G_4S)_3:AvBD6(G_4S)_3 AvBD6(G_4S)_3 AvBD6(4×AvBD6)串联基因序列,构建了表达rAvBD6的食品级乳酸菌表达菌株。经western blot检测显示,目的蛋白呈可溶性表达于乳酸菌细胞质中。以重组乳酸菌裂解上清为重组蛋白,与鸡外周血单个核细胞进行体外相互作用试验,荧光定量PCR结果显示,经r Av BD6刺激鸡外周血单个核细胞能够显著提高IL-10(p0.0001)、IL-12p70(p0.05)转录水平;重组蛋白与鸡巨噬细胞体外相互作用试验的荧光定量PCR结果显示,经rAvBD6处理的鸡巨噬细胞也能够提高IL-10、IL-12p70的转录水平(p0.05);重组蛋白刺激干扰素调节因子IRF信号激活报告细胞系774-Dual~(TM),结果显示rAvBD6显著激活了该巨噬细胞的IRF信号通路(p0.05);SPF鸡注射重组蛋白两周后,采用ELISA检测鸡血清IFN-γ、IL-2和IL-10表达水平,结果显示其IFN-γ、IL-10和IL-2的含量显著高于空菌对照组(p0.05)。上述结果表明:rAvBD6在体内外显示了较强的免疫激活和免疫调节特性,具有作为免疫佐剂或免疫增强剂的潜力。本研究为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定了基础。 相似文献
15.
鸭β-防御素10基因的克隆、遗传进化分析及其生物学特性的初步研究 总被引：3，自引：0，他引：3
旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.结果表明,鸭AvBD10 cDNA大小为169bp,编码55个氨基酸残基,与鸡AvBD10氨基酸同源性为85.5%.该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白的分子量约为30 ku,重组蛋白占菌体总蛋白的34%.重组鸭AvBD10蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性.结果,从鸭肝脏组织中扩增了鸭AvBD10基因,该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白具有广谱抗菌活性,该重组蛋白对温度和酸碱度有很高的稳定性. 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(9):1821-1828
建立绵羊瘤胃外植体(ovine ruminal explants,OREs)模型,并根据组织学变化和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达及CK-18和Ki-67的分布评估其活力。培养方案建立后,采用qPCR和ELISA方法检测β-葡聚糖刺激OREs对绵羊β-防御素-1(β-defensin-1,SBD-1)mRNA和蛋白表达水平的影响。HE染色,qPCR和免疫组织化学结果显示培养基内不添加血清培养24 h内的OREs的总体结构较完整,且具有活性。qPCR和ELISA显示,与对照组相比用β-葡聚糖刺激OREs后显著增加SBD-1的mRNA和蛋白表达(P0.05)。本试验确定了OREs体外培养的可行性和最佳条件,并证明β-葡聚糖可以激活瘤胃中抗菌肽SBD-1的分泌。 相似文献
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本试验旨在研究仔猪小肠优势乳酸杆菌在断奶前后的全肠道数量变化，并对部分优势乳酸杆菌的代谢差异进行了比较代谢组学研究。试验用梯度稀释培养法，分离21日龄哺乳仔猪的小肠优势乳酸杆菌。此外，试验选取24头体重为（7.00±0.50） kg的21日龄断奶长×大二元杂交去势公猪，随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。分别于21、24、28和35日龄时，每组随机选择1头仔猪屠宰，采集胃、空肠、回肠、盲肠和结肠内容物，用荧光定量PCR法定量分析胃肠内容物样品中的不同种类乳酸杆菌数量。另外，选取3株优势乳酸杆菌进行比较代谢组学分析。结果表明：试验分离获得了5株仔猪小肠优势乳酸杆菌分别为：食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、黏液乳杆菌（Limosilactobacillus mucosae）和唾液乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）。断奶后，仔猪胃肠内的乳酸杆菌数量降低，并随着日龄的增加逐渐恢复，但均未达到... 相似文献
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鹌鹑β-防御素10基因的克隆与表达及其体内分布的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为测定鹌鹑β-防御素10 (AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8％).将该基因亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中进行原核表达,SDS-PAGE电泳表明,鹌鹑AvBD10重组蛋白分子量约为31ku.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性,结果显示,鹌鹑AvBD10重组蛋白具有广谱的抗菌活性.采用定量RT-PCR法检测到AvBD10在鹌鹑脏器组织中广泛表达. 相似文献
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旨在探索益生性酿酒酵母菌及其灭活菌对绵羊瘤胃外植体内β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本研究建立了绵羊瘤胃外植体培养方法,将不同浓度(10~4、10~5、10~6、10~7、10~8、10~9 CFU·mL-1)的酿酒酵母菌及其灭活菌与外植体共培养24 h后,通过qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA和蛋白的表达变化,以分别确定活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达最高的菌液浓度;然后用该浓度的活菌及其灭活菌对瘤胃外植体进行不同时间(2、4、8、12、16、20、24 h)的刺激,同样用qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA及蛋白的表达变化,从而筛选出活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达的最佳时间。结果表明,益生性酿酒酵母菌及其灭活菌均能显著促进绵羊瘤胃外植体SBD-1的表达(P<0.05)。当酿酒酵母菌浓度为10~7 CFU·mL-1、灭活菌浓度为10~8 CFU·mL-1分别诱导绵羊瘤胃外植体16 h时,SBD-1表达量分别达到最大,且二者与对照相比均呈极显著差异(P<0.01)。在最佳诱导条件下对比二者的诱导效果,酿酒酵母菌活菌高于其灭活菌。因此,益生性酿酒酵母菌及其灭活菌均能促进绵羊瘤胃外植体内SBD-1的表达,且活菌浓度为10~7 CFU·mL-1、灭活菌浓度为10~8 CFU·mL-1分别诱导16 h时,绵羊瘤胃外植体内的SBD-1的表达量分别达到最大,并且益生性酿酒酵母菌的诱导效果高于其灭活菌。 相似文献
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研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2(SBD2)基因表达的影响,探讨P4调节SBD2表达的潜在机制。建立绵羊输卵管上皮细胞体外培养体系,用不同浓度(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L)P4分别处理绵羊输卵管上皮细胞0、2、6、12、24、48h,筛选P4诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD2mRNA表达的最佳条件。然后使用10-6mol/L孕激素核受体拮抗剂RU486,50μmol/L蛋白激酶C(PKC)信号通路阻断剂H7预处理细胞1h,再使用P4诱导SBD2mRNA表达的最佳条件处理细胞,同时设只添加阻断剂(RU486和H7)处理组、只添加孕酮(P4)处理组和空白对照组,通过RT-qPCR技术检测SBD2mRNA的表达变化。10-9mol/LP4诱导绵羊输卵管上皮细胞6h和24h时SBD2mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且与P4组相比,添加RU486和H7后显著抑制了P4诱导的SBD2mRNA的表达水平(P<0.01)。P4以浓度和时间依赖性方式显著增加SBD2mRNA表达,并且诱导可能通过孕酮核受体(PR)介导的基因组途径以及PKC信号通路来提高绵羊输卵管上皮的先天免疫防御能力。 相似文献