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1.
【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝... 相似文献
2.
旨在克隆并表达新疆褐牛CD46基因,制备其多克隆抗体,为进一步研究牛CD46分子生物学功能奠定基础。采用RT-PCR方法从新疆褐牛脾脏中扩增CD46基因全长,进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析,将CD46部分序列亚克隆于pET-28a(+)和pVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-28a-△CD46转化于E.coli Rosetta-gamiB(DE3)感受态细胞,诱导表达截短CD46蛋白。用切胶纯化的His-△CD46融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;采用ELISA测定多克隆抗体的效价;取无内毒素重组质粒pVAX1-△CD46转入BHK-21(仓鼠肾细胞)细胞,表达产物以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测该多克隆抗体的特异性。CD46基因的测序结果表明,部分基因蛋白表达、纯化条带大小与预期一致;制备的抗牛CD46多克隆抗体效价高于1∶128 000,并具有良好的特异性。 相似文献
3.
扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。 相似文献
4.
以旋毛虫成虫的总RNA为模板,应用RT-PCR扩增获得旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsAdSPI)基因。经克隆鉴定正确后,将TsAdSPI基因连接到pET-28a表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并将纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。应用Western-blot及ELISA方法对重组蛋白的免疫原性和抗体效价进行分析。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为44 k Da,以包涵体形式表达。经Western-blot和ELISA方法分析,制备的多克隆抗体效价可高达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。表明TsAdSPI蛋白可作为旋毛虫感染早期血清学诊断方法的候选抗原,为新型的抗旋毛虫及相关寄生虫药物研发打下结实基础。 相似文献
5.
为制备蛋鸡TRPV6蛋白多克隆抗体,根据其基因序列,设计1对特异性引物,以卵巢组织中提取的总RNA为模板,扩增蛋鸡TRPV6基因1 801～2 176nt的375bp序列,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-TRPV6;将重组质粒转化BL21（DE3）,经IPTG诱导表达TRPV6融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡TRPV6多克隆抗体,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法和Western blot检测抗体的效价和抗体特异性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-TRPV6,SDS-PAGE蛋白电泳检测发现目的蛋白大小约35 000;Western blot分析显示,表达的TRPV6融合蛋白具有良好的免疫原性,其抗体可与大肠杆菌表达的产物特异性结合;ELISA显示其抗体效价达1∶100 000。获得纯化的融合蛋白和多克隆抗体对研究TRPV6钙离子通道在蛋鸡髓质骨形成的作用机理具有重要作用。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2015,(7):1037-1041
应用RT-PCR方法扩增牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)VP2基因,构建重组质粒pET32a(+)-VP2。转化大肠杆菌菌株BL21,IPTG诱导其表达VP2融合蛋白,Western-blot检测目的蛋白。将纯化的重组蛋白(pET32a(+)-VP2)免疫新西兰大白兔,制备VP2多克隆抗体,iELISA方法检测抗体效价,同时利用血清中和试验评估其诱导中和抗体的能力。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白的相对分子质量为50 000,与预期值大小相符;iELISA检测其抗体效价为1∶25 600;血清中和试验表明,原核表达的VP2蛋白诱导产生的中和抗体效价为1∶107.4。结果表明,成功克隆和表达了具有免疫原性的VP2蛋白,其可诱导产生较高效价的多克隆抗体,为BEV血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
7.
《畜牧与兽医》2017,(9):67-70
根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。 相似文献
8.
为制备鸭补体调节因子H(CFH)的多克隆抗体,从健康雏鸭的肝脏组织中提取总RNA及反转录合成cDNA,PCR扩增补体调节因子H基因的2个片段H1和H2,插入到载体pMD19-T,测序正确后,将目的基因分别克隆至原核表达载体pCold-TF,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE检测,镍柱亲和层析纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果表明,成功构建重组表达质粒pCold-TF-H1和pCold-TF-H2,SDS-PAGE检测重组蛋白为可溶性表达,TF-H1和TF-H2多克隆抗体效价均超过1∶10000。所制备的多克隆抗体可以为进一步研究鸭CFH的功能奠定基础。 相似文献
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禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。 相似文献
10.
本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。 相似文献
11.
本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。 相似文献
12.
以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得SORF3(S3)基因,在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLys系统中原核表达。S3重组蛋白经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示外源基因以包涵体形式表达为主,分子质量约为52ku。重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,琼脂扩散法测得抗体效价为1:4。经Western blotting分析制备的多克隆抗体具有较高的特异性,间接免疫荧光试验证实制备的多克隆抗体与DEV的SORF3编码产物反应性良好,为进一步研究DEVSORF3结构与功能特性奠定了基础。 相似文献
13.
以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。 相似文献
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旨在利用原核表达系统表达基因Ⅱ型鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)ORF2蛋白,制备兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。根据GoAstV-GDZJ37株ORF2基因序列设计特异性表达引物,利用RT-PCR方法进行目的基因扩增,将其连接至原核表达载体pET-32a(+);经酶切鉴定和测序正确后,转化至表达感受态细胞,并进行诱导表达及SDS-PAGE分析。以无His标签的ORF2蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体。将含His标签的ORF2蛋白经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后的蛋白作为检测原,通过I-ELISA方法检测兔源多克隆抗体的效价,并通过Western blot及IFA检测方法鉴定其特异性。结果显示,克隆获得GoAstV-GDZJ37株ORF2基因,并利用原核表达系统分别表达2种重组蛋白,大小分别为77、95 kDa,且均为不可溶性表达。I-ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶102 400,表明无His标签的ORF2蛋白具有良好的免疫原性;Western blot及IFA结果显示,多克隆抗体可与含His标签... 相似文献
15.
本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(p PID1)重组蛋白,并制备p PID1多克隆抗体。将p PID1基因插入p ET28a(+),构建重组p ET28a(+)-p PID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒p ET28a(+)-p PID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定p PID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的p PID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备p PID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:p PID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1 mmol/L IPTG诱导4 h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为p PID1;特异性的p PID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20 480。本试验成功制备了高纯度的重组p PID1及其多克隆抗体。 相似文献
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非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列(登录号:NC_001659.2)设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。 相似文献
17.
《中国畜牧兽医》2018,(11)
为表达H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列(登录号:MG434500)设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380bp,可编码459个氨基酸,其中175-207bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 380bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。 相似文献
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利用PCR方法扩增乳源致病性金黄色葡萄球菌nEBPS全基因，将其定向克隆至原核表达载体pET30a（＋）中，鉴定正确后，转化BL21表达菌，经IPTG诱导获得了以可溶性表达的重组蛋白。通过NiNTAPurificationSystem纯化重组蛋白，纯化蛋白质量浓度为2．16g／L。纯化蛋白经免疫印迹检测显示重组蛋白能够被牛源金黄色葡萄球菌阳性血清识别，具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，间接EI，1SA测定抗体效价为1：25600，凝集试验测定抗体效价为1：128。 相似文献
19.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(9)
为了探究鸭肠炎病毒(DEV)TK基因编码蛋白在相关细胞上作用与功能及其在病毒感染周期、机体免疫应答中的作用,试验以DEV C-KCE株基因组DNA为模板扩增获得TK基因,在p ET-32a(+)/Rosetta(DE3)p Lys系统中原核表达,并用IPTG诱导DEV TK重组蛋白。结果表明:经SDS-PAGE分析,外源基因主要以包涵体形式表达,分子质量约为59 ku;经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价可达到1∶4;经Western-blot分析,制备的多克隆抗体可特异性识别重组蛋白;间接免疫荧光试验证实,制备的多克隆抗体与DEV的TK基因编码产物反应性良好。说明TK基因表达蛋白在鸭肠炎感染周期及机体的免疫应答中发挥着至关重要的作用。 相似文献
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山羊PTHrP基因的多克隆抗体制备和组织表达图谱分析 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在获得山羊PTHrP多克隆抗体,检测其在山羊各组织中的表达图谱,以便进一步研究山羊PTHrP的功能。本研究构建山羊PTHrP基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达获得融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白,然后将融合蛋白纯化后多点免疫大耳白兔,制备多克隆抗体,最后使用West-ern blot检测PTHrP在山羊各组织中的表达。结果,酶切和测序显示原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳结果说明融合蛋白(约36.5 ku)被成功纯化;间接ELISA检测所制备的抗体效价达1∶51 200;表达谱显示PTHrP在山羊乳腺、肾脏、垂体、脑、心脏、肝脏、骨、肌肉、脾脏等组织中均有表达。本研究成功制备了山羊PTHrP的多克隆抗体,发现PTHrP在山羊各组织中广泛表达。 相似文献