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1.
为研究禽波氏杆菌感染鸡后在体内组织器官中的定植规律及其在不同组织细胞中的定位、定量状况,本试验对禽波氏杆菌感染鸡组织器官的固定剂进行了筛选,制备石蜡切片,选择良好的粘片剂,利用纯化的兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG作为一抗,建立了能进行禽波氏杆菌抗原定位检测的间接免疫荧光组化法,并对禽波氏杆菌人工感染鸡进行了检测。经多次优化,确定将10%中性福尔马林作为固定剂固定组织24 h,0.1%多聚-L-赖氨酸作为切片的粘片剂。最佳工作条件为2%脱脂奶粉37℃封闭30 min;兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG 1:100稀释,4℃孵育过夜;荧光素标记羊抗兔二抗1:20稀释,37℃作用30 min。该方法重复性和特异性检测良好,对禽波氏杆菌感染雏鸡组织器官的检测结果表明,该法能特异性地对鸡组织器官中的禽波氏杆菌进行抗原定位,气管、肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏中的禽波氏杆菌抗原均呈现特异性荧光信号,同细菌分离鉴定方法检测的阳性符合率为99.27%。试验结果表明,本试验所建立的间接免疫荧光组化法可作为一种有效的检测方法用于禽波氏杆菌致病机制的研究。 相似文献
2.
本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。 相似文献
3.
禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用 总被引：3，自引：0，他引：3
采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏杆菌外膜蛋白（0MP）,通过Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量为320μg／mL,SDS-PAGE电泳检测发现禽波氏杆菌P5株OMP含有5种成分,相对分子质量分别为58、47、41、36、24ku;P8株OMP含有6种成分,相对分子质量分别为58、47、41、38、21、16ku。将提取的禽波氏杆菌OMP免疫健康青紫兰兔,每周免疫1次,共免疫4次,获得了兔抗禽波氏杆菌OMP高免血清,以此高免血清建立了检测禽波氏杆菌的间接ELISA和间接免疫荧光（IFA）方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10μg／mL、1：12800,酶标二抗工作浓度为1：5000,最佳包被条件为4℃、24h,最佳封闭条件为37℃、1h;间接免疫荧光（IFA）兔高免血清释释度为1：20,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1：10,感作时间为45min时,禽波氏杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为禽波氏杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。 相似文献
4.
《中兽医学杂志》2015,(9)
针对禽致病性大肠杆菌的F菌毛、P菌毛和HPI设计了三对引物,又在鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白保守区设计了一对特异性引物,建立检测鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌的多重PCR方法,并对临床采集的病死鸭病料组织进行检测,结果表明不同样品均可扩增出420bp、700bp、287bp、592bp的特异性目的条带,而对鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的扩增结果均为阴性,说明该多重PCR方法具有较好的特异性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌,也适用于病料的直接检测。利用建立的PCR方法对临床病料进行分子检测,并对检测为阳性的菌株进行药物敏感试验。 相似文献
5.
直接荧光抗体法检测禽波氏杆菌 总被引：1，自引：0，他引：1
制备了兔抗禽波氏杆菌特异性荧光抗体并建立了直接荧光抗体检测方法 ,对禽波氏杆菌在人工感染雏鸡内的致病机理作了初步研究。结果 ,该荧光抗体只与其相应菌株发生特异性荧光反应 ,而不与其他病原菌株发生反应。对人工感染发病雏鸡的检测结果表明 ,禽波氏杆菌主要定植于上呼吸道黏膜 ,并造成损害。该技术具有简便、快速、敏感和特异性强等优点 相似文献
6.
本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。 相似文献
7.
比较不同ELISA包被抗原对禽霍乱免疫血清的检测结果,选择最佳的包被抗原建立禽霍乱血清抗体的间接ELISA检测方法.分别 使用超声波裂解抗原、脂多糖蛋白抗原和全菌抗原作为包被抗原,应用间接ELISA方法检测 禽霍乱免疫血清,并对不同抗原建立的ELISA方法进行重复性试验.根据三种抗原对 免疫血清的检测结果以及重复性试验,发现全菌抗原的敏感度、特异性、稳定性均优于其他 两种抗原.全菌抗原作为ELISA包被抗原用于禽霍乱血清学检测具有敏感度高、特异性强、稳定性好的特点. 相似文献
8.
为了在大肠杆菌中表达支气管败血波氏杆菌prn基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR方法以败血波氏杆菌的基因组DNA为模板扩增prn基因,插入到pMD18-T克隆载体进行测序,并将目的基因插入原核表达载体pPro-HTa中,构建重组质粒pPro-HTa-prn,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因,并用SDS-PAGE和Western-blot检测该蛋白。结果表明:成功构建了重组质粒pPro-HTa-prn,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了prn基因;重组蛋白纯化前后均可与支气管败血波氏杆菌阳性血清发生特异性反应。说明支气管败血波氏杆菌prn基因获得成功表达,重组蛋白具有与天然蛋白一样的抗原特异性。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2017,(7)
为检测禽波氏杆菌鸡胚分离株和呼吸道分离株对雏鸡的致病性差异,本研究对2004年~2011年分离鉴定的12株禽波氏杆菌进行了鸡胚半数致死量和雏鸡半数致死量的检测,筛选强毒菌株进行雏鸡的鼻腔感染试验。结果表明LL、XT和AQ分离株的毒力最强,其它分离株的毒力稍弱。3株强毒菌株均可感染雏鸡呼吸道和肺脏,引起呼吸道症状以XT和AQ的症状最为明显,而在其它内脏中造成感染的鸡只比例以LL株最高,可达30%~40%;AQ最低,仅10%。HE染色结果显示对气管的损伤以XT最强,而肺脏、肝脏等内脏器官的病理变化以LL最严重。免疫酶组化试验也证实LL在内脏组织中的载量要多于XT和AQ。3株菌株均可导致雏鸡的生长抑制和免疫器官损伤,对新城疫灭活苗免疫后的抗体水平具有轻微的抑制作用,且均以LL的抑制作用最强。实验结果显示在所检测的12株禽波氏杆菌中,鸡胚分离株LL毒力最强,具有比呼吸道分离株XT和AQ更强的感染雏鸡内脏组织的能力,本研究为进一步鉴定禽波氏杆菌毒力因子和免疫原性奠定了基础。 相似文献
10.
本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测. 相似文献
11.
为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。 相似文献
12.
选择B亚型禽白血病病毒（ALV-B）感染雏鸡造成免疫机能低下,建立免疫抑制模型,以探索免疫抑制条件下共感染禽波氏杆菌后对雏鸡致病性的影响。设计了ALV-B单独感染组,B.avium单独感染组,ALV-B和B.avium共感染组,空白对照组,并且比较相互之间的差异。通过对雏鸡免疫学指标、生长性能及病毒血症和排毒状况的检测,对二者混合感染雏鸡的影响进行了研究。结果显示,ALV-B和B.avium共感染能引起雏鸡的免疫力低下,表现为免疫器官的发育、抗体的产生、淋巴细胞的转化、IL-2和IFN-γ的合成和分泌等受到明显抑制;混合感染组延长了B.avium的病程,增强其对雏鸡的致病性;同时机体出现明显的生长迟滞现象,尤其是第5周龄,共感染组平均体质量仅相当于对照组的40%。结果表明,ALV-B和B.avium在雏鸡体内的增殖方面起协同作用,从而促进了病原在鸡群间的散播;而B.avium对ALV-B导致的病毒血症有一定的抑制作用。在ALV-B免疫抑制作用下,B.avium对雏鸡的致病性显著增强。 相似文献
13.
2010年,辽宁铁岭某种鸡孵化场出现孵化率低、死淘率高的现象。通过对送检病死鸡胚进行病原检测,最终检测出5株革兰阴性杆菌和3种病毒,其中禽波氏杆菌和奇异变形杆菌的检出率分别为76．44％、61.36％,两者混合感染率达51．83％,而其他病原菌（大肠杆菌、沙门菌、绿脓杆菌）和病毒（AI,V、REV、CIAV）的检出率均较低。采用1对根据病原菌23SrRNA基因的共同保守序列设计的引物,以及根据临床常见致病菌16s～23SrRNA基因间隔序列（ISR）两端的16S及23SrRNA保守序列而设计的通用引物分别对分离菌进行PCR扩增。并分别测定所得片段的DNA序列。结果显示,所得DNA片段分别与GenBank中收录的登录号为HM545299的禽波氏杆菌和登录号为AY993943的奇异变形杆菌的相应核苷酸序列同源性达99．5％和98．7％。本研究最终确定禽波氏杆菌和奇异变形杆菌的混合感染是引起该场疫情发生的主要原因。 相似文献
14.
[目的]建立苦玄参提取物中苦玄参苷ⅠA的鉴别和含量测定方法。[方法]采用薄层色谱法对苦玄参苷进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定提取物中苦玄参苷ⅠA的含量,色谱条件为：Waters Symmetry C18（4.6×250 mm,5μm）色谱柱,流动相为乙腈—水（35∶65）,流速1.0 m L/min,检测波长264nm,柱温35℃,进样量20μL。[结果 ]苦玄参苷ⅠA的薄层色谱鉴别方法专属性强;苦玄参苷ⅠA在20.06～104.10μg/m L的质量浓度范围内线性关系良好（R2=0.9992）,平均加样回收率为99.90%,RSD=0.53%。[结论]建立的方法专属性强,定量准确性高,适用于苦玄参提取物的质量控制。 相似文献
15.
采用改进的水提醇沉法提取泰山松花粉粗多糖,并制备禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗。取1日龄SPF雏鸡300只,随机分为6组,I～V组分别免疫含有松花粉多糖100g／I。的禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗,Ⅵ组只免疫禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗,I、Ⅱ组在前2周分别口服高、低剂量的乳酸杆菌活菌菌液1mL,HI、IV分别口服高、低剂量的乳酸杆菌热灭活菌菌液1mL。在首免后,每周采取血液和小肠,用间接ELISA法检测血清抗体水平、MTT法检测外周血淋巴细胞转化率、全自动血细胞分析仪测定外周血淋巴细胞比率、ELISA法检测小肠sIgA含量和IL-2水平。结果表明,I～Ⅳ组抗体水平、IL一2含量、淋巴细胞比率、淋巴细胞转化率、sIgA含量显著高于V组、Ⅵ组（P％0．05）;V组各检测指标显著高于Ⅵ组（P〈O．05）;乳酸杆菌活菌组各检测指标比灭活菌组略高,高剂量组略高于低剂量组。因此,泰山松花粉多糖作为免疫佐剂能显著提高疫苗的免疫效果,同时1：3服乳酸杆菌能进一步增强动物对疫苗的免疫应答能力,口服乳酸杆菌活菌与口服热灭活菌效果差异不显著,泰山松花粉多糖和乳酸杆菌对增强禽波氏杆菌OMP疫苗的免疫力有协同作用。 相似文献
16.
为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。 相似文献
17.
为了建立兽用白头翁颗粒中白头翁皂苷B4的含量测定方法.利用HPLC法,采用HypersilC18柱（250 mm×4.6 mm,5μL）,以乙腈—0.1％磷酸（27∶73,V/V）为流动相,检测波长为205 nm,流速1.0 mL/min,柱温30℃.以白头翁皂苷B4对照为参比,在白头翁颗粒色谱图中,对白头翁皂苷B4的保留时间及峰面积的RSD进行分析.采用外标法测定3批白头翁颗粒中白头翁皂苷B4的含量.试验结果显示,白头翁皂苷B4在0.1～2.0 mg/mL范围内呈良好的线性关系,（r=0.9995,n=6）,平均含量为11.29mg/g,平均回收率为99.28％ （RDS=2.09％,n=9）.该方法操作简便、结果准确,重复性好,可用于兽用白头翁颗粒的质量控制. 相似文献
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微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定9种中兽药散剂中铅含量 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了微波消解-石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）测定9种中兽药散剂中铅含量的方法。采用微波消解技术处理样品,对消解溶剂、微波条件以及石墨炉原子吸收法的测定条件进行了优化。结果表明,以HNO3＋HClO4＋H2O2（4＋0.5＋1,V＋V＋V）作为微波消解溶剂最佳,基体改进剂Pd（NO3）2可有效地消除基体的影响。此方法的线性范围为5.00～80.00 ng/mL（r=0.9978）,检出限为0.39 ng/mL,添加回收率为87.1%～96.3%,相对标准偏差（RSD）为1.9%～6.9%（n=9）,将该方法应用于9种中兽药散剂中铅含量的测定,结果令人满意。 相似文献
19.
采用上游法分离优化精子,用mTyrod’s液(T)、BO液(B)以及高渗液(HIS)3种不同培养液,在5%CO2的培养箱中进行获能培养,获能培养时间为6h。利用考马斯亮蓝染色法检测精子顶体反应率,伊红-苯胺黑染色法检测活精子比率以及观测法检测精子活力。在培养的0、1、2、4、6h时分别检测上述指标并统计分析,从而筛选出适合蓝狐精子体外获能的培养液。结果显示:B培养液优于T、HIS培养液,最佳获能培养时间t≥6h;HIS可以提高精子顶体反应率,但较高的渗透压不利于精子保存,不建议使用。 相似文献
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An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Bordetella avium infection in turkey poults was developed. One-week-old poults challenged intratracheally with 10(12) colony-forming units of B. avium had detectable titers (greater than or equal to 11), with an average of 13.6% positive samples when the birds were 6 to 11 weeks old. The method was sensitive enough to detect maternal antibodies to B. avium in poults up to 3 weeks of age. The same poults challenged at 1 week of age had 100% tracheal infection up to 3 weeks of age, which dropped to 0% by 6 weeks. The method resulted in no false-positive samples (titer = 0) from birds not infected with B. avium and tested weekly between 4 and 11 weeks of age. Antibodies in turkey flocks infected with Newcastle disease virus, hemorrhagic enteritis virus, and Mycoplasma meleagridis, and birds infected with Escherichia coli had no apparent cross-reactivity to the B. avium antigens used in the ELISA. The percentages of B. avium-positive serum samples collected from different turkey flocks did not significantly differ (P greater than 0.05) when samples were tested by the developed ELISA at different times, an indication of the reproducibility of the method. 相似文献