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1.
《中国预防兽医学报》2015,(5)
为鉴定鸭肠炎病毒(DEV)的非必需基因,本研究利用增强型绿色蛋白(EGFP)基因为报告基因,通过在转染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,将其插入DEV基因组的TK基因中,经筛选和纯化绿色荧光病毒蚀斑,获得表达EGFP的重组DEV,命名为r DEVTK-EGFP。对重组病毒与亲本病毒DEV Clone-03复制动力学比较结果显示,重组病毒滴度显著低于亲本病毒(p0.01)。对重组病毒在复制过程中感染细胞能力和荧光表达时相检测结果表明,在感染后48 h~72 h表达荧光信号细胞明显增多,该结果与重组病毒复制动力学一致。将重组病毒在CEF中连续传代至20代,仍具有遗传稳定性。该研究结果表明,TK基因为DEV复制非必需基因,可以作为外源基因插入位点,用于禽用新型基因工程疫苗的研制。 相似文献
2.
采用非洲地区广泛应用的绵羊痘弱毒株构建表达小反刍兽疫病毒H蛋白的重组疫苗 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因的重组绵羊痘病毒(SPV),本研究利用e GFP报告基因和gpt筛选基因筛选纯化了PPRV H基因的重组SPV(rSPV-PPRV-H)。通过PCR、序列测定和间接免疫荧光的方法对rSPV-PPRV-H进行鉴定。结果显示PPRV的H基因重组至rSPV-PRRV-H中并表达PPRV H蛋白;同时病毒的生长曲线也显示外源H基因的插入并未影响亲本病毒的复制。将该重组病毒经皮内注射途径免疫绵羊,免疫剂量为105.5 TCID50,间隔4周,免疫两次,中和试验结果显示rSPV-PPRV-H免疫绵羊后能够诱导其产生高滴度的抗PPRV的特异性中和抗体,抗体转阳率为100%(6/6)。本研究为rSPV-PPRV-H作为PPRV疫苗提供了实验依据。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2015,(6)
为筛选新的高效的鸡痘病毒(FPV)中外源基因的插入位点,本研究选择FPV ORF161与ORF162之间的基因间隔区作为重组位点,构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转移载体,以表达鸡传染性喉气管炎病毒g B基因的重组FPV(r FPV-g B)为亲本病毒,通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,并经过蚀斑纯化筛选获得能够稳定表达gfp报告基因的重组病毒,命名为r FPV-g B161gfp。将r FPV-g B161gfp与亲本病毒连续传代20代,每5代进行荧光显微镜观察、PCR检测及复制动力学比较,结果表明重组病毒遗传稳定性良好,而且重组病毒与亲本病毒生长特性一致。本研究鉴定的新外源基因插入位点为构建多价重组FPV疫苗奠定了基础。 相似文献
4.
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
5.
6.
为探究bta-miR-205和bta-miR-497对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的调控作用,在前期建立BVDV感染MDBK细胞miRNAs差异表达谱的基础上,筛选出表达量显著差异的bta-miR-205和btamiR-497,通过生物信息学软件预测、荧光素酶报告基因检测等方法鉴定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因。应用RT-qPCR和病毒滴度测定等方法验证bta-miR-205和bta-miR-497对BVDV复制的影响。结果发现,bta-miR-205能显著抑制BVDV的复制,而bta-miR-497显著促进BVDV的复制。研究结果为BVD防控提供了新的思路和依据。 相似文献
7.
塞内卡病毒A（SVA）是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20 μmol·L-1的姜黄素和110 μmol·L-1黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。 相似文献
8.
PCR扩增山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK（Thymidine kinase）基因作为侧翼序列;用XhoⅠ/NotⅠ消化含有报告基因的质粒pLSEG得到痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）p7.5启动子调控大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（E.coli.gpt）作为报告基因;人工合成VV I1L启动子用于调控表达外源基因,用Overlap PCR的方法将VV I1L启动子和VV p7.5启动子调控的gpt连接但使两启动子转录方向相背,并在VV I1L启动子下游引入XhoⅠ位点作为外源基因的插入位点,构建成表达载体元件I1L-P7.5-GPT。将I1L-P7.5-GPT插入TK基因的Acc65Ⅰ位点,构建成表达载体。将构建的载体转染山羊痘病毒G14-STV44-55株感染的羔羊睾丸细胞,用含有霉酚酸（Mycophenolic acid,MPA）等筛选试剂的培养基筛选重组山羊痘病毒（rGTPV）。结果显示,构建成以TK基因为侧翼、以VV I1L启动子调控目的基因,以gpt为报告基因的表达载体pGEM-TK-I1L-GPT,成功筛选到表达gpt的rGTPV,rGTPV至少可稳定传代15代。结果表明,构建了我国山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株的表达载体;TK基因是GTPV G14-STV44-55疫苗株的复制非必需区,以TK基因为插入位点获得的重组病毒可稳定传代15代以上。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2017,(3)
RCAS载体系列是基于A型罗斯肉瘤病毒(RSV-A)所改造而成的反转录病毒感染性克隆,转染易感细胞后,能够产生高滴度的RSV-A病毒。同时,RCAS载体可携带外源基因进入靶细胞,从而进行蛋白的高效表达。为了获取滴度高且易于检测的RSV,进行ALV-J受体方面的研究,本研究将RCAS(A)-GFP载体中RSV-A的囊膜蛋白基因替换为ALV-J的囊膜蛋白基因,并将绿色荧光蛋白报告基因(gfp)替换为海参荧光素酶(luciferase)报告基因,构建带有luciferase报告基因的囊膜蛋白为ALV-J囊膜蛋白的RSV重组病毒。经验证,本研究所构建的重组病毒,与传统的ALV-J株相比,具有复制能力强,病毒滴度高等优点,而且能够通过ALV-J特异性受体ch NHE1感染ALV-J非允许细胞系,有利于病毒感染初期的检测和定量,为病毒与其受体之间相互作用的研究奠定了基础。 相似文献
10.
为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,笔者拟构建该病毒的微基因组并对其进行初步鉴定。采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了含有双报告基因的A型鸭肝炎病毒微基因组(pRluc-fLuc)。将pRluc-fLuc转染DF-1细胞,8h便可以检测到报告基因的表达,24h表达量达到峰值。上述结果表明,已经成功构建了A型鸭肝炎病毒微基因组,这为进一步研究病毒非编码区的结构和功能以及病毒的翻译或复制的调控机理提供了良好的技术平台。 相似文献
11.
禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。 相似文献
12.
本试验旨在利用TMT蛋白组学分析并筛选出抑制伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)复制的关键宿主蛋白。前期通过TMT定量蛋白组学技术筛选出241个差异蛋白，Western blot和RT-qPCR验证4个差异表达的蛋白，结果与蛋白组学结果一致，表明蛋白组学结果真实可信。通过构建4个差异表达蛋白的真核表达载体，Western blot、RT-qPCR、病毒噬斑结果显示这4个宿主蛋白均可抑制PRV的复制；然后通过双荧光素报告基因检测IFN-β启动子活性，结果显示，MCCC1、STRAP促进IFN-β启动子活性效果更为显著；针对MCCC1和STRAP设计siRNA,Western blot和病毒噬斑结果显示，敲低STRAP显著促进PRV的复制。本试验最终筛选出显著影响PRV复制的宿主蛋白STRAP,为研究PRV与宿主互作的分子机制奠定基础。 相似文献
13.
表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。 相似文献
14.
在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。 相似文献
15.
杆状病毒表达的猪传染性胃肠炎病毒钉状糖蛋白在其血清学诊断上的应用 总被引：3，自引：0，他引：3
利用从猪传染性胃肠炎病毒Ｍｉｊｌｌｅｒ株克隆建立的一株重组杆状病毒表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白，建立了一个种阻断酶联免疫吸附试验来检测猪群抗抗体。试验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种ｓｆ９细胞所表达的重组蛋白量在接种后第７２ｈ达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶＳ蛋白Ａ位点的单克隆抗体特异性结合。 相似文献
16.
《畜牧兽医学报》2020,(7)
在实验室前期利用猪肾细胞(PK-15)CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选到猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶(ALG5)的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA(gRNA)的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮(NPTr)细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID_(50)和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示:获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系(ΔALG5),ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
17.
为获得FMDV的衣壳蛋白前体P1和P1与3C基因的重组伪狂犬病毒,并评价两重组病毒的免疫效果,进行了本项研究。将构建的重组转移质粒pIESZP1和pUTK3CP1,用脂质体转染预先感染0.1 MOI PRV的Vero细胞,经120 h培养收获病毒后,再分别用蓝斑筛选和BrdU加压筛选重组病毒3~5次。经过挑斑纯化、扩增培养后用PCR、IFA检测筛选表达的FMDVP1蛋白。用这2株病毒分别免疫BALB/c小鼠,通过SN和ELISA方法检测免疫小鼠的抗体水平。成功地获得了2株可以正确表达目的蛋白的重组伪狂犬病毒rPRVP1和rPRV3CP1。2株重组病毒均可诱导小鼠产生特异性抗FMDV抗体,两重组病毒各项免疫指标之间没有明显的差异。 相似文献
18.
《畜牧兽医学报》2017,(2)
肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是天然免疫信号通路中重要的接头分子,笔者旨在探索猪TRAF6的抗病毒和免疫调控功能。首先利用RT-PCR从猪外周血单核细胞克隆该基因,并进行序列比对分析;其次利用Piggybac转座子系统建立猪TRAF6稳定表达的PK-15细胞系;最后在细胞水平检测猪TRAF6对伪狂犬病病毒复制的影响以及对猪IFN-β等启动子活性的影响。结果显示,猪TRAF6基因为1 623bp;将猪TRAF6基因连接到Piggybac转座子质粒成功构建真核表达载体PB-TRAF6,然后将重组质粒转染PK-15细胞,经药物处理和荧光筛选获得稳定表达TRAF6的细胞系;通过荧光定量PCR和Western blot确定稳定细胞系TRAF6的高效表达;体外抗病毒试验表明,TRAF6稳定细胞系能够显著抑制伪狂犬病病毒的复制;双荧光报告基因法检测发现,TRAF6可以促进poly(I:C)诱导的Ⅰ型干扰素应答。结果提示猪TRAF6具有显著的抗病毒和免疫调节功能,为研究TRAF6的免疫学功能奠定基础。 相似文献
19.
《蚕业科学》2017,(2)
柞蚕传染性软腐病病毒是从感染吐白水软化病的柞蚕体内分离的一株小RNA病毒,属于软腐病病毒属(Iflavirus),含解旋酶结构域的2C蛋白是该病毒的功能蛋白质之一。以感染柞蚕软腐病病毒的柞蚕蛹c DNA为模板,PCR获得2C蛋白的编码基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆粒p Fast Bac-Dual-GFP-Hel 2C,在昆虫细胞Sf9中表达了该病毒的2C蛋白。对重组2C蛋白的三磷酸核苷水解酶(NTPase)活性和解旋酶活性进行检测的结果显示:重组2C蛋白具有NTPase活性,能够水解4种NTP,并且具有解旋酶活性,能够解旋3'端至5'端方向单链突出的双链DNA。初步推测2C蛋白在柞蚕传染性软腐病病毒复制中发挥水解三磷酸核苷和解旋DNA链的作用。 相似文献
20.
为筛选山羊痘病毒(GTPV)的外源基因插入区,本研究以GTPV Pellor株为模板,设计2对引物,PCR扩增AV 41株GTPV_gp024基因相邻上下游长度约1.1 kb的同源重组片段,分别插入质粒pGPT-EGFP中.插入部位在痘病毒双向启动子p11～p7.5启动的报告基因EGFP-GPT上下游,构建转移载体pEG024,并转染已感染GTPV Av 41病毒的LT细胞,经GPT加压筛选7代后得到重组病毒.结果显示,重组病毒稳定表达报告基因EGFP,从而表明GTPV_gp024基因能够作为外源基因的插入区. 相似文献