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1.
为构建表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组疱疹病毒(HVT),本研究将AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表达质粒中,构建了转移载体pUAB-gpt-HA。通过同源重组及霉酚酸筛选技术,将HA基因表达盒插入到HVT US10基因区,构建了一株表达H5亚型AIV HA基因的重组病毒HVT(rHVT-US10-HA)。经PCR、间接免疫荧光、western blot及红细胞凝集试验鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。rHVT-US10-HA的构建为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2016,(2)
为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸭肠炎病毒(DEV),本研究以实验室前期构建的表达绿色荧光蛋白的重组DEV(r DEV-US10-EGFP)为基础,通过PCR扩增NDV F基因,构建了携带F基因表达盒的转移质粒p US10-TPA-F。将转移质粒与r DEV-US10-EGFP基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞。经过反向蚀斑筛选,获得表达NDV F基因的r DEV-US10-F。对重组区域US10基因测序结果表明,F基因正确插入至US10基因编码区内。将重组病毒传至15代,F基因仍能够稳定表达,表明重组病毒具有稳定的遗传特性,并且与亲本病毒株具有相似的生长曲线。本研究为研发NDV-DEV活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2019,(8)
为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中适合外源基因插入的复制非必需区,本研究利用本实验室前期建立的DEV疫苗株多片段拯救系统,结合E/T克隆技术、LR克隆技术将含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的目的片段,定向插入到含DEV基因组复制非必需区的粘粒中,该位点位于DEV基因组UL区的UL44.5和UL44之间,拯救获得了重组病毒(rDEV)。通过PCR和荧光显微镜鉴定该重组病毒。结果显示,经PCR扩增,r DEV可以扩增到预期目的片段,观察可见红色荧光,表明RFP基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果显示,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。将r DEV以105 TCID50的剂量免疫SPF鸭后,DEV攻毒保护试验结果显示,r DEV和亲本株DEV活疫苗对SPF鸭的保护效率均为100%。本研究筛选到DEV基因组中的一个可供外源基因插入的位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗研制提供依据。 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中的复制非必需区,本研究在已建立的DEV疫苗株5粘粒拯救系统的基础上,利用转座子随机插入技术,将含eGFP表达框架的基因片段随机插入DEV US区,救获两株表达绿色荧光蛋白的重组DEV(rDEV-us7eGFP、rDEV-us8us1eGFP)。将两株重组病毒在鸡胚成纤维细胞中连续传至20代后,通过PCR、荧光表达鉴定分析,结果显示gfp基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。攻毒保护实验结果表明,将rDEV-us7eGFP和rDEV-us8us1eGFP以10~5TCID_(50)的剂量免疫SPF鸭后,其对鸭瘟强毒攻击的保护效率与DEV疫苗株一致,均为100%。本研究成功筛选到DEV基因组中的两个可供外源基因插入的复制非必需区,分别位于us7基因内部及us8与us1基因之间,为以DEV为载体构建相关重组疫苗奠定了重要基础。 相似文献
5.
采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA. 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2015,(5)
为鉴定鸭肠炎病毒(DEV)的非必需基因,本研究利用增强型绿色蛋白(EGFP)基因为报告基因,通过在转染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,将其插入DEV基因组的TK基因中,经筛选和纯化绿色荧光病毒蚀斑,获得表达EGFP的重组DEV,命名为r DEVTK-EGFP。对重组病毒与亲本病毒DEV Clone-03复制动力学比较结果显示,重组病毒滴度显著低于亲本病毒(p0.01)。对重组病毒在复制过程中感染细胞能力和荧光表达时相检测结果表明,在感染后48 h~72 h表达荧光信号细胞明显增多,该结果与重组病毒复制动力学一致。将重组病毒在CEF中连续传代至20代,仍具有遗传稳定性。该研究结果表明,TK基因为DEV复制非必需基因,可以作为外源基因插入位点,用于禽用新型基因工程疫苗的研制。 相似文献
7.
8.
为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2017,(11)
为构建同时表达禽流感病毒(AIV)HA蛋白及传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(r HVT),本研究以本实验室构建的连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的5个重组粘粒(p Fos A、p Fos B、p Fos C、p Fos D和p Fos E)为基础,利用猪捷申病毒2A蛋白的编码序列,将HA基因和VP2基因串联,并克隆于p CAGGs载体中,构建重组质粒p CA-HA-2A-VP2。利用Gateway LR克隆技术,将重组质粒中的HA-2A-VP2的表达盒(Pec-HA-2A-VP2-POLYA)插入到p Fos C粘粒中HVT片段的复制非必需区HVT053与HVT054基因之间,构建重组粘粒p Fos C-5354-HA-VP2。将p Fos A、p Fos B、p Fos D、p Fos E和p Fos C-5354-HA-VP2 5个重组粘粒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),制备表达HA蛋白及VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(r HVT-5354-HA-VP2)。将重组病毒在CEF中连续传至20代后,通过PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定分析,结果显示HA与VP2基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与野生型病毒HVT无显著差异。该重组病毒的制备为研制AIV-IBDV-马立克病毒三联苗奠定了基础。 相似文献
10.
鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白[2]、鸭坦布苏病毒E基因[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。 相似文献
11.
通过PCR方法从人工合成的质粒(232HAc-T)扩增获得全长的HA基因和缺失信号肽及跨膜区的HA基因。将此HA基因克隆至杆状病毒表达系统,构建重组穿梭载体rBac-232HAc和rBac-232HAδST,转染Sf9细胞后获得重组的杆状病毒rAc-232HAc和rAc-232HAδST。重组病毒在Sf9细胞中表达2种重组蛋白232HAc和232HAδST。2种蛋白在SDS-PAGE和Western blot检测中均获得预期目的条带,间接免疫荧光(IFA)检测呈阳性。血凝试验结果显示,232HAc蛋白能够使红细胞凝集,血凝(HA)效价为8log2;而232HAδST的HA效价低于2log2。血凝抑制试验结果表明,232HAc蛋白与H5阳性血清反应良好,效价类似于H5检测抗原对照,但不与其他病毒血清反应。结果提示:2种重组蛋白均能在Sf9细胞中表达,但重组232HAc蛋白能具有较好的血凝性,并能被H5阳性血清特异性抑制。本研究为研发H5亚型禽流感HA蛋白亚单位疫苗提供了生物材料。 相似文献
12.
为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA33段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。 相似文献
13.
为了构建融合表达分子佐剂猪补体C3d与猪流感病毒血凝素(HA)的真核表达载体,论文克隆了猪C3d全长基因与H3N2亚型猪流感病毒的HA基因,并构建了包含3拷贝的C3d和经过改造的HA(替换信号肽并去除跨膜区)的质粒pHA-C3d3.序列分析表明,获得的猪C3d与参考序列相比核苷酸同源性达到99.7%,氨基酸同源性达99... 相似文献
14.
经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。 相似文献
15.
应用DNAStar软件,参照GenBank中注册的AIV H5亚型毒株HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H5亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H5 HA基因插入转移质粒载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-H5HA并将其转化DH10Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H5HA,再将其转染昆虫细胞High Five,PCR鉴定证实该基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经SDS-PAGE和Western blotting检测,HA基因在High Five细胞中得到了表达,表达产物大小约为67 ku,而且具有特异的免疫反应性. 相似文献
16.
以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
17.
旨在构建鸭肠炎病毒（DEV）UL41基因缺失毒株,并对其生物学特性进行分析,本研究以克隆有DEV UL41基因的重组黏粒D1为骨架,利用Red/ET重组技术构建缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41;将UL41基因缺失重组黏粒D1 dUL41与其他4个克隆有DEV基因组片段的亲本黏粒共转染鸭胚成纤维细胞（DEF）,拯救获得UL41基因缺失毒株rDEV-SD19/dUL41。将该基因缺失病毒感染DEF后,提取病毒基因组进行PCR鉴定及测序,并利用间接免疫荧光试验检测该病毒感染细胞中UL41基因表达情况;绘制拯救的基因缺失病毒的生长曲线,分析其体外复制特性。PCR及测序结果显示,本研究成功构建了缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41。将该基因缺失黏粒与其他含有DEV基因组的亲本黏粒共转染DEF后能够产生典型的蚀斑病变。PCR及测序结果显示,UL41基因成功从DEV基因组中缺失;间接免疫荧光试验发现,基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41感染DEF后,未见UL41蛋白表达。综上表明,本研究成功构建了DEV UL41基因缺失病毒。体外生长曲线显示,rDEV-SD19/dUL41在DEF中的复制能力明显低于亲本病毒,提示UL41蛋白在DEV复制中发挥重要作用。UL41基因缺失DEV的构建为进一步研究UL41基因在DEV感染和致病中的作用机制奠定了基础。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2014,(8)
为构建表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白重组新城疫病毒(NDV)及比较密码子优化的HA免疫增强作用,本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建了表达野毒型H5N1亚型AIV HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组NDV,并分别命名为rL-H5HA和rL-optiH5HA。对拯救的重组病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定,结果表明,两种重组病毒均可以在BHK-21细胞中以及鸡胚成纤维细胞稳定地表达HA蛋白。此外,rL-optiH5HA在体外增殖能力及在体内刺激产生抗体均显著高于rL-H5HA。本研究表明,密码子优化的HA重组NDV具有明显的免疫增强作用。本研究为研制安全、有效的新型禽流感疫苗提供了实验依据。 相似文献
19.
为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。 相似文献
20.
为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。 相似文献