共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
1.
提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。 相似文献
2.
流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。 相似文献
3.
参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。 相似文献
4.
乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：5，自引：2，他引：3
收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
5.
为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×105;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×104;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。 相似文献
6.
通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)猪源化单链抗体scFv-Fc。提取抗PEDV杂交瘤细胞2D1的总RNA,通过反转录与SOE-PCR方法获得单链抗体scFv基因,同时提取猪脾脏组织的总RNA,RT-PCR获得猪免疫球蛋白恒定区Fc基因。通过SOE-PCR方法将scFv与Fc连接获得猪源性单链抗体scFv-Fc融合基因,构建重组质粒pET-28a-scFv-Fc,将该重组质粒转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析及Western blot检测融合蛋白的特异性,再对表达蛋白进行纯化和复性,通过间接ELISA鉴定融合蛋白与PEDV的结合活性。结果显示,插入pET-28a载体的scFv-Fc序列长度1 128bp,抗PEDV猪源化单链抗体的相对分子质量为45 800,重组蛋白具有较高的特异性。本研究成功构建了pET-28a-scFv-Fc原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为PEDV重组抗体的研究奠定理论基础。 相似文献
7.
马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
8.
通过对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成1对引物,利用PCR扩增出NS1’移码片段,并将移码片段克隆入pET-32a表达载体中。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,经IPTG于20℃过夜诱导,实现了目的片段的可溶性表达。对表达产物进行SDS-PAGE鉴定,可检测到分子质量约为25 ku的融合蛋白。以日本脑炎病毒野毒株和弱毒株感染小鼠血清为一抗,进行Western blot分析,原核表达蛋白仅与野毒感染小鼠血清发生特异性反应,说明该蛋白具有区分临床野毒感染和疫苗免疫的潜力。 相似文献
9.
《中国畜牧兽医》2019,(12)
本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(11):2114-2120
原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
11.
《中国兽医学报》2020,(3)
以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。 相似文献
12.
《中国兽医学报》2016,(5):772-777
为制备水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)重组M蛋白的鼠源多克隆抗体,本研究将扩增的VSV-M基因插入到pET-28a载体中,构建了pET-28a-VSV-M原核表达载体,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE和Western blot检测结果发现重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为31 000。之后应用His GraviTrap 10prepacked gravity flow columns纯化重组M蛋白,并将其免疫小鼠,制备VSV重组M蛋白的多克隆抗体;间接ELISA方法检测其抗体效价为1∶12 800。将该抗体应用于VSV的检测,在稀释倍数为1∶800时仍可检测到清晰的条带,且大小与预期的一致,证实了其与病毒的特异性结合。结果表明,本研究成功构建了VSV-M蛋白的原核表达载体,将表达纯化后的VSV-M蛋白免疫小鼠成功制备了VSV-M蛋白的多克隆抗体,这为后期检测VSV-M基因的表达分布、功能特性及开发诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
13.
根据GenBank发表的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因序列,合成用于克隆编码病毒NS3蛋白C端的基因片段(955~1857 bp)的引物。从感染JEV的细胞样品中,采用RT-PCR扩增出大小约900 bp的目的片段,插入到pET-28a(+)表达载体,诱导表达出NS3C蛋白。将该重组蛋白免疫小鼠制备NS3C抗血清,通过间接免疫荧光和Western blot验证,该抗血清能特异识别JEV感染Vero细胞中的NS3蛋白。使用该抗血清研究了JEV在神经细胞内的亚定位,发现NS3主要定位于JEV感染的神经细胞的胞浆中,并在细胞核周围分布明显。 相似文献
14.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
将泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)CP15基因从pMD18-T-CP15重组质粒中切下,连接至pET-28a(+)原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,并将纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。结果显示,重组表达载体pET-28a-CP15在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白分子量约为17 kDa。Western blot显示重组蛋白能被泰泽隐孢子虫感染小鼠血清所识别。ELISA结果显示重组蛋白免疫小鼠血清能和泰泽隐孢子虫卵囊可溶性抗原特异性反应,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。 相似文献
15.
为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1∶32 000,Western blot鉴定抗体能特异性识别原核表达的pET-28a-IgA-H蛋白,并能有效地将双峰驼IgA与IgG区别开来,表明成功获得了双峰驼IgA重链恒定区的重组蛋白及特异性良好的多克隆抗体。 相似文献
16.
犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。 相似文献
17.
《中国兽医学报》2017,(12):2300-2303
为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。 相似文献
18.
为建立稳定共表达乙型脑炎病-毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E.将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系.经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白.该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础. 相似文献
19.
根据GenBank公布的日本脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2减毒株E基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增其E基因全长cDNA,将扩增产物克隆入pUCm-T载体中,测序后亚克隆到原核表达载体pET-32a( ),筛选重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌.经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物.结果获得了含全长日本脑炎病毒E基因的重组质粒,经测序证实,与GenBank上E基因序列的同源性达到100%.所表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,为制备JEV实验室诊断抗原打下了基础. 相似文献
20.
猪圆环病毒1型和2型Rep蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
分别以猪圆环病毒1型基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,利用PCR扩增了猪圆环病毒1型和2型的ORF1基因,随后克隆到pET-28a( )和pET-32a( )两种原核表达载体上。测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3),进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,猪圆环病毒1型和2型的ORF1均能在pET-28a和pET-32a中分别以重组蛋白His-Rep(40 Ku)和Trx-His-Rep(54 Ku)的形式表达。进一步纯化后测定重组蛋白的浓度,推算出猪圆环病毒1型和2型的His-Rep蛋白产量分别为34 mg/L菌液和14 mg/L菌液,Trx-His-Rep蛋白产量则为12 mg/L菌液和10 mg/L菌液。这些纯化的蛋白在Western blot中能够与猪抗猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫学活性。本研究建立的猪圆环病毒重组Rep蛋白的原核表达系统及其纯化方法,为下一步开展Rep蛋白功能等相关研究奠定了基础。 相似文献