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1.
为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。 相似文献
2.
Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。 相似文献
3.
为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
4.
传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达 总被引：11，自引：1，他引：10
将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。 相似文献
5.
《畜牧兽医学报》2015,(6)
为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。 相似文献
6.
为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。 相似文献
7.
将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。 相似文献
8.
猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备 总被引：4，自引：1，他引：4
利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV）石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术（FACS）分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性. 相似文献
9.
为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础. 相似文献
10.
通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。 相似文献
11.
将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
12.
根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。 相似文献
13.
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
14.
试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。 相似文献
15.
为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。 相似文献
16.
非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45 ku,且具有良好的生物活性。 相似文献
17.
为研究传染性造血器官坏死病病毒（infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）主要结构蛋白糖蛋白（G）,本研究采用RT-PCR方法从IHNV中提取RNA并进行反转录,经PCR方法扩增获得1 380 bp的G蛋白基因片段,将其克隆到pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中,成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G,转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得了重组杆粒rBacmid-G。将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒。间接免疫荧光（IFA）和Western blotting分析显示,重组G蛋白可与抗组氨酸单抗（Anti-His）、抗IHNV鼠血清发生特异性反应,表明本研究克隆的IHNV G蛋白在真核表达系统中得到正确表达,且该蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为研究G蛋白的功能及开发IHNV新型疫苗奠定了基础。 相似文献
18.
XIE San-lei WEN Shu-xiang LUO Lin MA Zhi-hong LI Gui-ping LI Tie-liang JIANG Na XING Wei SUN Hui-ling 《中国畜牧兽医》2017,44(3):854-860
To study the major structural protein glycoprotein (G) of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), glycoprotein gene (1 380 bp) was amplified by RT-PCR from IHNV. In order to construct a recombinant plasmid pFB-LIC-Bse-G, G gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse. Then, the constructed plasmid pFB-LIC-Bse-G was transformed into E.coli DH10Bac. The recombinant bacmids rBacmid-G was got, and then it was transfected to insect Sf9 cells,and the recombinant baculovirus that contained G gene was obtained. Western blotting analysis and indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the recombinant G protein could be recognized by histidine monoclonal antibody (Anti-His) and anti-IHNV antibody of mouse. The results indicated IHNV G protein had been expressed correctly in Sf9 cells. The study laid a foundation for further studying the G protein structure, function and immunological characteristics. 相似文献
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20.
利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。 相似文献