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1.
《中国畜牧兽医》2018,(12)
试验旨在对羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因进行克隆、原核表达及纯化,并对表达蛋白toxA-N进行生物信息学分析,为探索羊源多杀性巴氏杆菌毒素基因的相关特性提供参考依据。以羊源多杀性巴氏杆菌基因组为模板,参考GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌HN06中toxA基因序列(登录号:CP003313.1)设计引物,通过PCR技术扩增出目的片段,构建重组质粒pET28a(+)-toxA-N,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后,经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定,纯化蛋白并运用生物信息学软件对表达蛋白进行特性分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 515bp的toxA-N基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到大小约为5 369和1 515bp两条片段,表明成功构建了pET28a(+)-toxA-N重组质粒,IPTG诱导表达的菌株经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定后,成功表达出大小约为60ku的toxA-N蛋白;生物信息学分析表明,toxA-N蛋白为包涵体,其分子式为C2635H4002N664O797S17,原子总个数为8 115,消光系数为84 480,不稳定指数为43.50,亲水性平均值为-0.381。在toxA-N蛋白二级结构中,α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占53.47%、2.77%、11.28%和32.48%,与三级结构预测结果一致。本试验通过对toxA-N基因的初步研究,揭示了多杀性巴氏杆菌毒素的相关特性,对家畜的疾病预防、诊断、治疗具有重要意义。 相似文献
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本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
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为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。 相似文献
4.
本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C_(1684)H_(2619)N_(457)O_(505)S_3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
5.
为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原，本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原，将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化，经序列分析鉴定后，分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中，构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示，构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp，与GenBank中相关序列具有高度同源性；3个蛋白片段表达正常，表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL，SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku；因3个片段位置不同，仅Tox3有Western blotting检测条带，与理论预测相符；使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后，二免后14 d，血清经试剂盒检测阳性率达到100%，对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段，且具有较好的免疫原性。 相似文献
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试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2019,(11)
为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原,本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原,将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化,经序列分析鉴定后,分别使用BamHⅠ、HindⅢ与BlpⅠ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1(Tox1)、片段2(Tox2)和片段3(Tox3)分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中,构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示,构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp,与GenBank中相关序列具有高度同源性;3个蛋白片段表达正常,表达量分别达到379.95、447.62与459.82μg/mL,SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku;因3个片段位置不同,仅Tox3有Western blotting检测条带,与理论预测相符;使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后,二免后14 d,血清经试剂盒检测阳性率达到100%,对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段,且具有较好的免疫原性。 相似文献
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羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。 相似文献
9.
参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。 相似文献
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羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a(+)载体相连,构建pET-28a(+)-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645bp的目的片段,并表达出大小约28ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07(GenBank登录号:CP007040.1)和Pm70(GenBank登录号:AE004439.1)株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87(40),在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30h,疏水指数为82.15,总平均疏水性(GRAVY)为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。 相似文献
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试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列（登录号：CP003313.1）设计1对引物，通过PCR扩增获得目的基因片段，构建pET-28a（+）-recN重组质粒并转化E.coliDH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明，试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列，通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku，主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析，recN蛋白的分子式为C2735H4428N786O855S16，消光系数为24 785，不稳定系数为43.99，属于不稳定蛋白；理论等电点（pI）为5.62，为酸性蛋白；总平均亲水性为-0.316，与试验表达的包涵体蛋白性质相同，即同为疏水性蛋白；recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h，在酵母（体内）中的半衰期>20 h，在大肠杆菌（体内）中的半衰期>10 h；二级结构主要以α-螺旋（64.87%）及无规则卷曲（21.00%）为主；经疏水性分析，预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。 相似文献
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试验旨在克隆鸭疫里默氏杆菌协同溶血素蛋白(cooperative hemolysin protein,CAMP)基因,并对其进行原核表达和生物信息学分析。以RA贵州血清2型分离株RA-SS-8基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌CAMP基因,构建pET-28a-CAMP重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,重组菌用IPTG进行诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用相关生物信息学分析软件对CAMP基因进行分析。结果显示,鸭疫里默氏杆菌CAMP基因大小为1 026 bp,该基因序列与GenBank中公布的10株RA参考菌株(如RA-LZ01(CP045564.1))CAMP基因的相似性达99.7%。经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,获得大小约5 369和1 026 bp的基因片段,表明pET-28a-CAMP重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,表达的重组蛋白大小约为37 ku,以可溶形式进行表达,且能与His-tag单克隆抗体在37 ku处产生特异性反应,与预期结果相符。生物信息学分析表明,CAMP蛋白分子式为C1670H2659N437O500S12,含341个氨基酸,理论等电点(pI)为5.62,不稳定系数为40.71,表明其为不稳定的弱酸性蛋白。疏水性预测结果显示,该蛋白属于亲水性蛋白。CAMP蛋白无跨膜结构域,无信号肽,有3个O-糖基化位点,无N-糖基化位点,存在34个磷酸化位点,共有17个抗原表位。二级结构和三级结构预测结果显示,CAMP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验结果为进一步研究鸭疫里默氏杆菌CAMP蛋白的功能及鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研发提供了参考。 相似文献
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类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析 总被引：2，自引：2，他引：0
试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因进行克隆与原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因序列，设计1对引物。通过PCR扩增得到大小为1 641 bp的groEL基因片段，将其连接至pMD19-T载体，构建pMD19-T-groEL重组质粒，经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定正确后，构建重组质粒pET-28a（+）-groEL。将鉴定正确的pET-28a（+）-groEL质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导表达，运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定，利用DNAMAN和BioEdit等软件进行生物信息学分析。结果发现，试验成功克隆了类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因并进行了蛋白表达，表达的融合蛋白大小约为64 ku，GroEL蛋白的分子式为C4510H7381N1641O1840S521，原子总个数为15 893，消光系数为32 500，不稳定指数为40.31，亲水性平均值为0.901。GroEL蛋白二级结构中α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、无规则卷曲（Cc）分别占48.71%、13.19%和38.10%。本试验结果为深入探究类鼻疽杆菌groEL基因的分子作用机理奠定了基础。 相似文献
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【目的】试验旨在获得高效表达的鼠伤寒沙门菌SptP蛋白并进行生物信息学分析,为其功能研究和互作蛋白的筛选提供理论依据。【方法】通过PCR技术扩增SptP基因,并将该序列连接至pET-32a （+）载体,构建鼠伤寒沙门菌SptP基因原核表达载体pET32a-SptP。通过热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达、纯化重组蛋白,并经过SDS-PAGE和Western blotting验证;应用在线软件对SptP蛋白进行生物信息学分析。【结果】PCR成功扩增出大小为1 632 bp的SptP基因。SptP重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功诱导表达、纯化,得到分子质量为79.7 ku的蛋白。SptP蛋白分子式为C2625H4257N745O812S25,分子质量为60 047.68 u,无跨膜结构,无信号肽存在,理论等电点为8.75,有57个潜在的磷酸化位点,主要定位于细胞核、细胞质、高尔基体、细胞骨架、分泌系统的囊泡、质膜,占比分别为43.5%、34.8%、8.7%、4.3%、4.3%和4.3%。SptP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲组成,占比分别为43.65%、14.92%、4.42%和37.02%。【结论】本研究构建了表达SptP蛋白的重组质粒pET32a-SptP,获得分子质量为79.7 ku的SptP重组蛋白,阐明了SptP蛋白的基本理化性质和生物学功能,为后续SptP蛋白与宿主细胞互作的作用机制及鼠伤寒沙门菌新疫苗的制备提供理论基础和试验依据。 相似文献
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D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究 总被引：3，自引：3，他引：0
利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。 相似文献