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1.
以大肠杆菌表达、纯化的禽白血病病毒（ALV）重组P27蛋白为包被抗原,建立了检测ALV-P27抗体的间接ELISA方法,为禽白血病流行病学调查提供了一种简便的血清学检测方法.该方法与9种禽常见传染病病毒阳性血清及大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于10％,具有良好的重复性;新建立的ELISA方法比IDEXX公司生产的ALVA、B亚群抗体检测试剂盒和J亚群抗体检测试剂盒相对于免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率. 相似文献
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采用细胞培养法增殖禽白血病／肉瘤病毒（ALV／RSV）A亚型，然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒，再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白。经检测，提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性。用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体，经ELISA方法检测其效价可达1：6400以上。 相似文献
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从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。 相似文献
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抗禽白血病p27抗原单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
检测p27抗原的检测试剂在禽白血病的研究和防治方面有着极其重要的作用.为研究国产的禽白血病诊断试剂,利用禽白血病各亚群病毒的p27蛋白很保守的特点,我们将原核表达的禽白血病p27蛋白作为抗原,免疫8周龄的BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得三株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过Western-blotting和ELISA的结果分析证明,三株单抗与原核表达得p27蛋白和禽白血病各亚群病毒反应,而不与禽流感病毒等反应.可以看出,这三株单抗在ALV的抗原分析、血清学诊断和疫苗质量监测以及禽白血病污染细胞检测等方面有着极其重要的应用价值. 相似文献
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间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。 相似文献
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为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。 相似文献
8.
《山东畜牧兽医》2019,(12)
为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-Kgp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测血清抗体效价;对血清抗体进行纯化并检测抗体亚型,Western-blot和IFA检测抗体对ALV-Kgp85蛋白和病毒识别特性。结果表明,获得的抗体效价达到8×10~7,抗体亚型为IgG2b,该抗体能够特异性识别ALV-Kgp85蛋白和DF1细胞中的ALVK病毒,可以用于IFA临床检测,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。 相似文献
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禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。 相似文献
10.
禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：6，自引：0，他引：6
从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT-PCR方法扩增出720bp的gag P27基因片段,克隆至pMD18-T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97.3%.将该片段亚克隆至pGEX-6 P-1原核表达载体,转化受体菌BL-21,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%.表达产物经Glutathion Spharose4 B树脂亲和层析法纯化后,每100 mL菌液最终可获得5 mg重组t27蛋白,蛋白纯度在90%以上.用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性.用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应.所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础. 相似文献
11.
在本实验室分离鉴定J亚群禽白血病病毒的基础上,用PCR方法扩增gp85基因,长度为921 bp的DNA片段,与J亚群禽白血病标准毒株序列比对同源率为96.4%。将该片段连接到pET28a表达载体上,构建了重组表达质粒pET28a-S1-Jgp85,对质粒测序后分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为40 kD的融合蛋白。Western blot结果表明,表达产物可以与ALV-J阳性血清发生特异性反应。以纯化的His-Jgp85重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法,用于J亚群禽白血病的临床诊断。本研究对抗原包被浓度,待检血清稀释浓度,酶标抗体浓度,特异性试验及临界值等条件进行优化,对优化后的ELISA检测方法进行了临床应用试验。本研究建立了能特异性检测J亚群禽白血病血清抗体的ELISA方法。 相似文献
12.
根据大肠杆菌密码子偏嗜性修改、合成胸腺肽alpha 1（Tα1）基因并连接到pET32α（＋）中构建融合表达载体pET32α-Tα1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导,经15%SDS-PAGE检测,Tα1获得可溶性表达。将诱导表达菌高压均质破碎后进行亲和层析纯化,洗脱蛋白峰经脱盐处理后进行免疫活性测定。通过脾淋巴细胞转化试验测定纯化重组Tα1和人用Tα1的活性,结果显示,重组表达的Tα1具有明显的促进淋巴细胞增殖的活性;脱E受体法E玫瑰花环试验测定结果显示,制备的重组Tα1的E玫瑰花结百分率高于空白对照组14.3%以上（胸腺肽溶液的质量标准为提高10%）,能够明显增强T细胞的活性。 相似文献
13.
根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
14.
病毒蛋白VP2是兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV）的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗VP2的抗血清。对制备的抗VP2抗血清进行特异性分析,再利用该抗体对转染pEGFP-VP2的BHK-21细胞进行检测,以研究VP2蛋白在细胞内的定位情况。结果表明,pEGFP-VP2转染BHK-21细胞后,不仅VP2蛋白得到了成功表达,而且通过检测偶联的绿色荧光蛋白可判断出VP2蛋白主要分布于BHK-21细胞的细胞质。本研究成功构建了VP2与绿色荧光蛋白融合的表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现VP2主要在细胞质内表达并分布,为深入探讨VP2的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。 相似文献
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J 亚型禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性.本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J Sl gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析.结果表明:ALV-J Sl gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间.这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础. 相似文献
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采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。 相似文献