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1.
为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒.重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1).间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达.rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础. 相似文献
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利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献
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AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础. 相似文献
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为研制鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV) VP1蛋白单克隆抗体,用已鉴定的Ⅰ型DHV的全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,并以构建的原核重组质粒pET-VP-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的VP1蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后获得l株针对Ⅰ型DHV VP1蛋白的特异性单克隆抗体.对该株单克隆抗体的特性鉴定发现其特异性强、中和性较好.该抗体为今后Ⅰ型鸭肝炎病毒的检测试剂盒研制提供了重要的生物制剂. 相似文献
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为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT-PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM-T Easy中得到重组克隆质粒pGEM-T-VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamHⅠ、XholⅠ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM-T-2VP1,然后将双拷贝VP1基因亚克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-2VP1。结果表明:得到了含有目的基因的阳性克隆。说明Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因原核表达质粒构建成功。 相似文献
6.
根据Genbank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的包含有EcoRV和xhoⅠ酶切位点的引物，用该特异性引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1，以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体，经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因正确插入了表达载体，转化宿主菌RossetaⅡ，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1在大肠杆菌RossetaⅡ中表达量较高，表达产物的分子量约为48ku、并能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清所识别。Ⅰ型鸭肝炎病毒VPI蛋白在大肠杆菌RossetaⅡ中表达产物具有免疫原性。 相似文献
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为了提高基因A型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）VP1基因在昆虫细胞中的表达水平,本研究根据昆虫细胞密码子偏爱性对野生型DHAV VP1（wtVP1）基因进行改造,合成了optiVP1基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建了重组杆状病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1,分别转染对数生长期的sf9昆虫细胞表达VP1蛋白。转染72 h后,sf9细胞出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）, Western-blot和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果表明VP1蛋白在重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得了良好表达。用Image J软件对Western-blot扫描的图片进行灰度分析发现, optiVP1基因在昆虫细胞中的表达水平明显高于wtVP1。本研究为进一步研制诊断抗原和新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。 相似文献
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通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69ku。 相似文献
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应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714 bp,GenBank登录号:GU363950。对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性。VP1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 相似文献
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为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。 相似文献
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WANG An-ping ZHU Shan-yuan WANG Yong-juan WU Shuang ZUO Wei-yong HONG Wei-ming 《中国畜牧兽医》2015,42(11):2862-2866
In order to express the F protein of duck Newcastle disease virus (NDV) in insect cells,one pair of specific primers was designed according to the published genome sequences of duck NDV to amplify F gene by PCR,the amplified fragment was cloned into baculovirus expression vector pFastBac1.Then the recombinant vector pFastBac-F was transformed into E.coli DH10Bac competent cells,and the positive recombinant bacmid rBacmid-F was screened according to the resistance and blue-white plague screening.rBacmid-F was transfected into Sf9 insect cells by liposome,once the cytopathic effect was found,the rBac-F could be aquired.The results of Western blotting and indirect immunofluorescence test showed that the recombinant proteins could be recognized by positive serum,indicating that the protein had good reactiongenicity.These results suggested that F protein of duck NDV had been successfully expressed in insect cells,which laid the foundation for the prevention and control of duck Newcastle disease. 相似文献
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本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
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以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。 相似文献
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牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：2，自引：1，他引：1
本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。 相似文献
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为表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通过RT-PCR方法克隆RV Flury LEP病毒株G基因,将其克隆至质粒pFastBacHTα中,重组质粒pFastBac-RV-G转化DH10Bac感受态细胞,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV-G,将其转染昆虫细胞sf21获得含有G基因的重组杆状病毒.采用SDS-PAGE和western blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析,以重组G蛋白作为包被抗原的ELISA检测36份犬血清样品.结果表明,在Bac-to-bac杆状病毒系统中表达的RV G蛋白能与his-tag单克隆抗体及RV阳性血清发生特异性反应,其相对分子量为60 ku;与以RV为包被抗原的商品化ELISA试剂盒相比,以重组RV G蛋白为抗原建立的间接ELISA的敏感性、特异性和符合率分别为80%、81.8%和80.6%,表明杆状病毒系统表达的RV G蛋白是检测RV抗体的理想抗原蛋白,作为一种亚单位疫苗具有潜在的应用前景. 相似文献
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为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。 相似文献
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将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。 相似文献
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ZHAO Wen-nian WANG Qing-hua LIU Chun-ju WANG Shu-juan LEI Cheng-hong BAO Jing-yue WANG Zhi-liang 《中国畜牧兽医》2014,41(8):29-33
In order to obtain purified peste des petits ruminants virus F protein, the F gene of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07 was cloned into transfer vector pFastBac/CT-TOPO, plasmid pFastBacCT-PPRV-F was then transformed into DH10Bac complement cells. The recombinant bacmid DNA was isolated and transfected into sf9 insect cells to express F protein. The expressed F protein was identified by using SDS-PAGE, Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The recombinant F protein was successfully expressed in insect cells with a relative molecular of 59 ku.The sf9 cells infected by Bacmid-PPRV-F can reacted with positive serum of peste des petits ruminants.Using the Bac-to-Bac baculovirus expression system expressed the F protein of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07.This work provides basis for development of rapid test for detection of peste des petits ruminants antibody. 相似文献