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1.
本研究利用RT-PCR技术，从鸡法氏囊淋巴瘤细胞系DT40中扩增slgMλ轻链基因并在E．coli中进行了表达。序列分析结果表明，sIgMλ轻链基因全长852nt，含有一个长度为657nt的ORF及长度为195nt的3′-UTR，该基因与鸡Igλ基因的序列同源性为95％，差异位点主要存在于λ轻链的可变区。氨基酸序列预测结果表明，DT40sIgMλ蛋白与鸡Igλ蛋白的序列同源性为92．6％。构建的原核表达载体pET-λ在E．coli BL21（DE3）中成功的获得大量表达。本实验为进一步研究sIgM在IBDV感染法氏囊B淋巴细胞中的作用奠定了基础。 相似文献
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用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。 相似文献
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为研究致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌(E.coli) fimFGH基因的变异情况,本实验根据GenBank中登录的序列设计引物,PCR扩增了3株致鹩卵黄性腹膜炎性E.coli E0238、E0239、E0240 Ⅰ型菌毛的fimFGH基因并测序.序列比对分析结果表明,3株细菌的fimF、fimG和fimH基因及其所编码的蛋白... 相似文献
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《中国兽医杂志》2020,(6)
为了分析2019年禽腺病毒(FAdV)遗传变异情况,通过PCR分段扩增、测序,获得11株FAdV Hexon基因序列。经分析发现,11株腺病毒Hexon基因高变区核苷酸序列同源性为66.1%～100.0%,推导编码的氨基酸序列同源性为56.5%～100.0%;与参考株核苷酸序列同源性为65.4%～100%,与参考株氨基酸序列同源性为56.5%～100.0%。其中9株序列基因长度均为738 nt,编码246个氨基酸;GX-1901001毒株序列基因长度均为750 nt,编码250个氨基酸;HB-1911039毒株序列基因长度均为756 nt,编码252个氨基酸。与目前流行株相比,本试验获得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的变异或缺失,在进化树中已形成多个小分支。表明我国FAdV在流行过程中已出现变异。本试验结果为监测和分析我国FAdV的变异和演化提供了有价值的基因信息数据。 相似文献
6.
从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。 相似文献
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从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。 相似文献
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根据国外已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18) c DNA基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR技术 ,从鸡新城疫 系病毒接种 4 8h左右的罗曼鸡胚脾细胞中扩增出鸡 IL - 18全基因 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增片段全长 5 94 bp,共编码 198个氨基酸的前体蛋白 ,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡 IL - 18全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 10 0 % ;序列中编码成熟蛋白的这段基因与国内报道的源自白来航鸡编码 IL- 18成熟蛋白的基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 99.4 %。本研究为鸡 IL - 18的扩增及其他细胞因子的扩增提供了一种简便易行的新方法 ,为进一步研究IL- 18基因的结构、功能、表达及表达产物的应用奠定了良好基础 相似文献
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《水禽世界》2020,(7)
本研究通过病毒分离、RT-PCR和测序分析等方法,从广东某肉鸡场发生法氏囊和胸腺严重萎缩的鸡群中分离了1株传染性法氏囊病毒,命名为GD2020株。氨基酸序列分析结果显示,分离株VP2基因高变区与近期国内分离的法氏囊病毒新型变异株SHG115株同源性为99.1%,与早期变异株Variant E株同源性为97.5%,与经典毒株、超强毒株和弱毒株同源性在89.3%～94.1%之间。进化分析结果表明,GD2020株与SHG115株属于同一分支,与早期变异株和经典毒株亲缘关系较远。GD2020株感染不引起鸡只死亡和出现腿肌出血等典型临床症状,但能引起法氏囊严重萎缩。本研究为广东地区传染性法氏囊病的防控提供了数据支持。 相似文献
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致猪水肿病大肠杆菌鄂E株菌毛F18基因FedF亚基的克隆、表达及其生物学特性 总被引：1，自引：0，他引：1
以致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,通过PCR的方法扩增大肠杆菌菌毛F18主要亚基FedF的全长及去信号肽亚基因FedFs,扩增片段分别为1000、900 bp。将纯化的扩增产物克隆到pMD18-T中,通过酶切鉴定和序列分析表明,含SacⅠ及HindⅢ酶切位点的基因全长为967 bp,鄂E株FedF基因编码区全长903 bp,编码301个氨基酸,碱基序列同标准株107/86的同源性为100%。与菌毛AF/R1相比,编码的蛋白质没有同源性。利用pGEX-KG分别构建表达载体,SDS-PAGE检测表明FedFc/pGEX-KG无表达带,FedFs/pGEX-KG则有约58 000的特异性表达带;West-ern blotting检测表明重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白GST-FedF免疫新西兰兔所制备的抗血清,能抑制Ee株与刷状缘细胞的粘附。利用表达的蛋白建立了F18的ELISA检测方法,并检测790份临床送检血样,其中536份呈阳性,血清学阳性率为67.8%。结果表明,FedF是猪大肠杆菌病新型疫苗及F18^＋E.coli感染鉴别诊断的良好候选抗原,通过本试验建立的ELISA方法揭示国内的F18^＋E.coli感染严重,血清学阳性率高达67.8%。 相似文献
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为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。 相似文献
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为了解我国近年来新出现的禽副黏病毒4型（APMV-4）的生物学特性,对2020年分离鉴定的3株鸭源APMV-4进行致病性分析和基因组测定。结果显示：3株APMV-4分离株F蛋白裂解位点均为116DIPQR↓F121,1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）为0~0.23,对鸡表现为低致病力。3株分离毒株基因组长度均为15 054 nt,基因组结构顺序均为3''-N-P-M-F-HN-L-5'',符合典型的副黏病毒基因组“六碱基原则”;病毒3''端具有55 nt的前导序列,5''端存在17 nt的尾随序列,各基因间有9~42 nt的基因间隔序列;3株分离毒株与APMV-4代表株同源性最高（97.2%~97.5%）,与其余禽副黏病毒同源性为37.1%~47.3%,与中国香港、韩国分离株高度同源。结果表明,我国新出现的鸭源APMV-4为弱毒株,基因组序列同源性较高,关键氨基酸位点未发生变异。本研究为进一步了解APMV-4 和科学防控APMV-4感染提供了参考。 相似文献
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为了解我国新出现的禽副黏病毒14型（APMV-14）的基因组特性,对2022年从我国家禽中新分离到的2株APMV-14毒株进行了基因组测序和序列分析。结果显示：两株毒株基因组长度均为15 444 nt,结构均为3''-N-P-M-F-HN-L-5'',3''前导序列和5''尾随序列长度分别为55和277 nt,各基因间隔序列长度不等（2~36 nt）;2株毒株F蛋白裂解位点均为99REGR↓L103,具有低致病性禽副黏病毒分子特征;2株毒株HN蛋白长度均为607 aa,明显长于2011年日本分离株APMV14/duck/Japan/11OG0352/2011（580 aa）。同源性分析显示,我国分离的2株不同宿主来源的APMV-14毒株基因组核苷酸同源性为99.5%,与APMV-14代表株11OG0352同源性最高（91.0%）,与其余禽副黏病毒同源性仅为45.0%~52.3%;遗传进化分析显示,2株APMV-14毒株与日本APMV-14分离株（11OG0352）位于同一分支。综上所述,本研究中的2株来源于不同宿主（鸡和鸭）的APMV-14毒株基因组序列高度同源,说明APMV-14已具备水禽—陆禽的跨种传播能力。本研究为APMV-14生物学特性等相关研究奠定了基础。 相似文献
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为研究牛源的化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)生物学功能,本研究应用PCR方法扩增牛源化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)PLO全基因序列,通过生物信息学方法分析其与猪源A.pyogenes的PLO蛋白差异,并构建了溶血功能区重组表达质粒pQE30-PLO585,在E.coli XL1Blue中用IPTG诱导表达。结果表明,扩增到PLO蛋白基因ORF为1 605 bp,编码535个氨基酸,与猪源PLO的核苷酸序列同源性为97.4%,氨基酸同源性为97.2%,在生物学活性功能区没有发生改变。表达的PLO蛋白溶血功能区重组蛋白能够被阳性血清识别,而且具有溶解绵羊红细胞的活性,产生β溶血现象。本研究获得了牛源A.pyogenes截短重组PLO蛋白,并证明PLO具有β溶血功能与较好的抗原性。 相似文献
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蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征 总被引：1，自引：1，他引：0
从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%. 相似文献
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抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合. 相似文献
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本研究旨在对鸡FK506结合蛋白5(FK506 binding protein 5,FKBP5)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在鸡不同组织中的表达量。以鸡脾脏cDNA为模板,通过PCR方法扩增和克隆鸡FKBP5基因完整CDS区序列,并进行同源性比对及系统进化树构建;使用在线软件分析FKBP5蛋白的理化性质、疏水性、跨膜结构、信号肽、二级结构和三级结构;利用实时荧光定量PCR检测其在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)组肉鸡和正常组肉鸡组织中的表达量,并绘制组织表达谱。结果显示,鸡FKBP5基因CDS区序列全长1350 bp,编码449个氨基酸;同源性比对和进化树分析表明,鸡FKBP5基因氨基酸序列与鹌鹑、鸭、壁虎、中华鳖、小鼠、人、猪、斑马鱼的同源性分别为98.4%、96.2%、85.8%、87.4%、81.1%、85.2%、86.1%和61.2%,与鹌鹑、鸭的亲缘关系最近,爬行类和哺乳类动物次之,与斑马鱼(鱼类)亲缘关系最远。鸡FKBP5蛋白分子质量为50.43 ku,理论等电点(pI)为5.94,半衰期为30 h,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为23.80,属于稳定蛋白;跨膜区和信号肽预测结果显示,FKBP5蛋白不属于跨膜蛋白和分泌型蛋白。结构域分析结果表明,该蛋白包括2个FKBP型肽基脯氨酰异构酶(FKBP-type peptidylprolyl isomerases)、3个四肽重复(TPR)序列,主要包含α-螺旋(46.77%)、延伸链(12.47%)和无规则卷曲(40.76%),且该蛋白与HSPA2、PPID、STIP1、HSP90AA1和HSP90AB1等互作蛋白具有很强的相关性。实时荧光定量PCR结果显示,FKBP5基因在鸡各组织中广泛表达,其中在软骨和法氏囊中表达量较高,在发病组肉鸡组织中的表达量均高于正常组肉鸡,且在心脏、腿肌、法氏囊、胸腺、软骨中表达量差异显著(P<0.05),在脾脏中表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果可为肉鸡骨骼疾病及腿部健康选育提供参考。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(11):1725-1731
为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 相似文献