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1.
为了研究猪IL-2基因的真核质粒和融合基因形式对pcDNA—E39．VP2真核共表达质粒的免疫增强作用,分别将IL-2基因插入pcDNA3．1（＋）和pcDNA—E39．VP2（已构建）中构建重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-E39．VP2。将真核质粒pcDNA-IL2-E39．VP2免疫小鼠,另外,将pcDNA—IL2分别先于和后于pcDNA-E39．VP23d免疫小鼠,同时设pcDNA-E39．VP2对照组。对免疫小鼠进行PPV（JEV）抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖功能和外周血T淋巴细胞亚群变化的检测。结果显示,1周后,pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组和pcDNA—IL2后于pcDNA—E39．VP注射的免疫组JEV／PPV抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖活性显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）高于对照组,pcDNA-IL2先于pcDNA—E39．VP注射的免疫组仅在第5周显著（P〈0．05）高于对照组;各组（除对照组外）CD8^＋值差异不显著（P〉0．05）,CD4^＋、CD4／cD8值都高于对照组,其中pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组与对照组差异极显著（P〈0．01）。结果表明,IL-2能增强pcDNA-E39．VP诱导小鼠的免疫能力,且以融合基因形式构建的真核质粒免疫增强效果最明显。 相似文献
2.
以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板，应用RT—PCR方法，克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2 cDNA全序列，并将其与真核表达质粒pcDNA4．0定向连接，构建了重组质粒pcDNA4．0-E。经提纯后，给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4．0-E，每只100μg，15d后再注射1次，同时设空白对照组。于二免后第10、20、30d分别扑杀小鼠，进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验，并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示，与空白对照组相比，所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖（P〈0．01），血清抗体水平从二免后的第10d开始逐渐升高，且极显著高于对照组（P〈0．01）。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。 相似文献
3.
构建绵羊梅迪-维斯纳病病毒（MVV）核心蛋白Gag核酸疫苗并与IL．2联合免疫小鼠，为评价其诱导的体液和细胞免疫应答。将MVVgag基因与羊IL-2基因分别插入到核酸疫苗载体质粒pcDNA5．0中，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5.0-IL-2，并经酶切以及测序鉴定。分别用阳性质粒pcDNA5．0-Gag、空载体pcDNA5．0及pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2共免疫BALB／C小鼠，采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体以及IFN-γ和IL-4水平，用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖。结果表明pcDNA5．0-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IFN-γ、IL-4水平高于pcDNA5．0-Gag免疫组，与空载体pcDNA5．0对照组相比有显著差异（P〈0．01）。且pcDNA5．0-Gag单独免疫组及与IL-2联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数均高于空载体pcDNA5．0对照组。因此，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2，用其联合免疫BALB／C小鼠所诱导的免疫反应以特异性细胞免疫应答为主，同时可产生体液免疫，且IL-2发挥了免疫佐剂的作用，为进一步将其用于MVV的防治奠定了基础。 相似文献
4.
猪圆环病毒2型核酸载体构建及分子免疫研究 总被引：1，自引：1，他引：0
利用PCR技术和亚克隆技术构建了猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白基因与猪a—IFN基因的真核双表达质粒pIRES—Cap—α—IFN,经酶切、PCR鉴定和测序表明构建成功。将该质粒免疫6～8周龄BALB／c纯系小鼠,每隔2周免疫1次,共免2次,每次免疫前采血分离血清,实验结束时杀鼠取脾制备T淋巴细胞。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体水平,用MTT法检测T细胞增殖情况。结果表明,pIRES-Cap—α—IFN免疫组能显著刺激T淋巴细胞增殖（P〈0．05）,促进机体产生体液免疫但差异不显著（P〉0．05）,为PCV2核酸疫苗研究奠定了较好的前期基础。 相似文献
5.
抑制素基因免疫对小鼠生殖的影响 总被引：32，自引：5，他引：27
用编码抑制素α（1－32）的基因与pcDNA3.1真核表达质粒进行重组，构建抑制素基因疫苗NH。将30只2周龄ICR小鼠随机分为3组（每组10只），试验Ⅰ，Ⅱ组分别经脂质体介导肌肉注射iINH15μg()0μL,25μg(100μL)，对照组注射免疫空载体pcDNA3.115μg(100μL)。首次免疫后间隔3周加强免疫1次。小经pINH基因免疫后，用ELISA可从血浆中检测到抑制素抗体，表明pINH可在活体肌细胞内表达，表达产物具有制素抗原性，能激活免疫系统产生抑制素抗体。抑制素抗体P／N＞2视为阳性，阳性率为30％（6／20）。抑制素抗体阳性小鼠与阴性小鼠的产仔数，初生重和窝重等没有显著差异（P＞0．05）。抗体阳性组首次免疫后，雌鼠血浆FSH浓度略有升高，经过加强免疫后显著升高（P＜0．05）。由此可以看出，抑制素基因免疫可以诱导产生抗抑制素抗体，并促进促卵泡素的分泌。 相似文献
6.
基因枪与肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠体液及细胞免疫的比较研究 总被引：8，自引：2，他引：8
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗（pcDNA—PRRSV—ORF5）以不同免疫途径（基因枪和肌肉注射）免疫BALB／c小鼠，以PBS和空载质粒pcDNA3．1（＋）为对照，采用流式细胞仪（FACS）、淋巴细胞增殖试验（MTT法）及间接ELISA试验分别对小鼠外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数、T淋巴细胞的转化功能及小鼠血清中特异性PRRSV血清抗体IgG动态变化进行了检测。结果表明，pcDNA—PRRSV-ORF5基因疫苗接种小鼠后外周血对ConA有明显的反应性，试验组与对照组比较差异极显著（P〈0．01）或显著（P〈0．05），CD4^＋T淋巴细胞数在免疫后7d高于对照组（P〈0．01），CD8^＋T淋巴细胞在免疫后28d高于对照组，不同途径基因疫苗接种小鼠后均诱导小鼠产生PRRSV特异性IgG。在诱导细胞免疫方面，基因枪和肌肉注射各组间无明显差异；在诱导体液免疫方面，基因枪法优于肌肉注射。研究表明制备的pcDNA—PRRSV—ORF5基因疫苗免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的体液和细胞免疫应答，基因枪法较肌肉注射更能诱导体液免疫应答的产生。 相似文献
7.
减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫原性 总被引：4，自引：4，他引：4
将携带鸡柔嫩艾芙耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3—5401的减毒沙门氏菌ZJ111菌株（ZJ111／pcDNA3—5401）口服接种于3日龄非免疫鸡，2周后进行第2次接种。结果表明．利用该减毒沙门氏菌作为戴体具有相对安全性，用限制性酶切分析和PCR鉴定证实，体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。用ZJ111／pcDNA3—5401（10^4cfu）口服接种非免疫鸡．2周后用相同剂量加强免疫1次，二免后2周用柔嫩艾笑耳球虫孢子化卵囊攻击，观察其免疫效果。结果表明，重组ZJ111／pcDNA3—5401菌既能诱导产生抗鸡柔嫩艾芙耳球虫抗体，也能显著增强淋巴细胞增殖水平（P〈0．05）；其抗球虫指数为164．98。试验结果显示，利用减毒沙门氏菌为戴体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。 相似文献
8.
CpG-ODN增强表达犬瘟热病毒H蛋白重组质粒免疫效果的分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为提高犬瘟热病毒（caninedistempervirus,CDV）重组质粒的免疫应答水平,合成4条CpG-寡脱氧核苷酸（CpG—oligodeoxynueleotides,CpG-ODN）;通过体外淋巴细胞增殖试验确定1条刺激活性最显著的CpG-ODN,序列为5＇-TCGTcGTTTTGTCGTTTTGTcGTT-3’。将30只缝康毕格犬随机均分为2大组,每大组再分为5小组,分别以不同的剂量肌肉注射CDV附着蛋白（H）重组质粒pcDNA—H和选定的CpG-ODN。在免疫后的第2、4、6周分别测定各组动物的抗CDV中和抗体和γ-干扰素水平。结果表明选定的CpG-ODN对提高抗CDV中和抗体效价和干扰素水平具有一定作用,且与对照组差异显著（P〈0．05）;但不同剂量的质粒pcDNA—H和CpG-ODN的效果不同,其中以30μg／只的CpG-ODN和50ug／只的pcDNA—H的剂量组合效果最佳。以选定剂量的CpG-ODN和pcDNA—H免疫5只健康毕格犬,同时以质粒pcDNA—H与生理盐水作为对照;4周后所有动物均接种CDV组织匀浆毒。结果发现试验组动物均未出现犬瘟热临床症状,且攻毒后第3周CDV检测为阴性,而peDNA—H对照组和生理盐水对照组动物的CDV检测阳性率为2／5和5／5;这表明CpG能够明显促进重组质粒pcDNA—H的免疫保护作用。 相似文献
9.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导小鼠的细胞免疫 总被引：2，自引：2，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5基因疫苗（pcDNA—PRRSV—ORF5）以50、100、200μg 3个剂量肌注免疫BALB／c小鼠，以PBS和空载体质粒pcDNA为对照，采用流式细胞仪（FACS）、淋巴细胞增殖试验（MTT法）分别时小鼠外周血中CD4^＋、CD8^＋ T淋巴细胞数和淋巴细胞转化功能进行了检测。结果，3个剂量的pcDNA—PRRSV—ORF5接种小鼠后，其外周血都对ConA有明显的反应性。试验组与对照组比较差异极显著（P〈0．01）或显著（P〈0．05），CD4^＋ T淋巴细胞数在免疫后7d高于对照组（P〈0．01），CD8^＋ T淋巴细胞在免疫后28d高于对照组，大剂量基因疫苗免疫小鼠的细胞免疫应答高于中、小剂量。结果表明，pcDNA—PRRSV—ORF5免疫小鼠能够诱导机体产生良好的细胞免疫应答，并表现一定的剂量依赖性。 相似文献
10.
猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答 总被引：2，自引：0，他引：2
以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组质粒pHN为模板，Li-15和Li-2为上、下游引物扩增出TGEVTH98／N基因。将N基因与真核表达载体pcDNA3．1( )分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后连接，构建了重组真核表达载体pcDNA—N。将昆明鼠随机分为2组，分别肌肉注射pcDNA—N和pcDNA3．1( )，每只鼠100μg，共免疫3次，每次间隔2周。首次免疫后第0、14、21、28、35、39、47和54d采血分离血清，采用ELISA检测抗体动态变化。注射pcDNA—N组小鼠在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。 相似文献
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根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基... 相似文献
14.
根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。 相似文献
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采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒（GPV）的检测抗原，利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VPl与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP（1-3），分别转染sf9细胞，得到重组病毒，分别表达出了54ku的NS2融合蛋白和24ku的VP（1-3）融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实，表达产物具有特异性；间接免疫荧光试验证实，重组蛋白在细胞中获得了表达。 相似文献
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为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。 相似文献
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为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV—1）UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响，构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3．1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3．1 E2-UL49。将pcDNA3．1-E2与pcDNA3．1-E2-UL49分别转染293T细胞，间接免疫荧光试验结果显示，单独表达E2蛋白的细胞，其荧光主要固缩于核周，而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光；Western-blot分析结果显示，VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达．但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些（P〈0．01），表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。 相似文献
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利用PCR方法成功克隆了鸡痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）4b核心蛋白基因549bp片段，序列分析表明，该序列与模板DNA（AF198100）碱基序列的同源性为99．45％，只有3个碱基差异，第215位由C→T，第386位由T→A，第388位由G→A。回收FPV4b核心蛋白基因549bp片段，以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测，结果显示其标记效率为100mg／L；敏感性检测表明，该探针对同源DNA的检出限量为10Pg；特异性检测结果表明，用本试验所标记的探针对提取的FPV282E4和FPV儿株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性，而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均成阴性，说明该探针具有较强的特异性。初步应用表明，本试验所建立的FPV的基因探针检测法可用于FPV的检测。 相似文献