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1.
为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。 相似文献
2.
《中国家禽》2016,(14)
2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。 相似文献
3.
为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。 相似文献
4.
本文就2008年在江苏某鸡场分离到的一株发生抗原变异的H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Huadong/4/2008(wt-DT株)开展如下研究:利用反向遗传技术,删除wt-DT株病毒血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,再与wt-DT株的神经氨酸酶(NA)基因组合,结合鸡胚高产病毒PR8株的6个内部片段骨架,构建针对此种变异H5亚型禽流感的疫苗株,结果成功拯救出重组病毒rH5N1/PR8.病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,相对于wt-DT株,rH5N1/PR8在MDCK细胞上的繁殖能力明显提高.rH5N1/PR8对SPF鸡和鸡胚无致病性,在鸡体内的免疫保护效果良好,符合疫苗候选株的标准. 相似文献
5.
近年来Clade2.3.2H5N1亚型的禽流感病毒逐渐成为我国及越南等其他一些国家流行的优势毒株,并呈现出一定变化规律的氨基酸进化趋势。本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.3.2H5N1亚型AIV A/chicken/Yangzhou/1117/2011(YZC3)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的COS-1细胞中救获低致病性的疫苗毒株。结果成功拯救出1株重组病毒rYZC3,该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,对SPF鸡和鸡胚无致病性。本研究为防控当代流行的H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。 相似文献
6.
第2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒(AIV)抗原性目前已发生显著变异。为应对变异株可能引发的流行,利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N1亚型AIV A/duck/JS/ZJ/2016(H5N1)(ZJ,第2.3.2.1d分支)、A/Chicken/SD/YT/2015(H5N1)(YT,第2.3.2.1e分支)的基因组为模板,扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行修饰,去除裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征,成功构建了第2.3.2.1分支H5N1亚型AIV疫苗候选株rZJ和rYT。抗原性分析显示,rZJ和rYT与Re-6疫苗株之间的抗原性已有显著差异。免疫效力试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗免疫21 d的平均HI抗体效价分别达到8.8 log2和8.9 log2,说明重组疫苗具备良好的免疫原性。免疫攻毒保护试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源H5N1病毒100%的保护,而针对第2.3.2.1分支的Re-6疫苗仅能提供大约40%和30%的保护。利用反向遗传技术构建的rZJ和rYT重组候选疫苗株为该分支病毒的防控提供了技术支持。 相似文献
7.
为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。 相似文献
8.
为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。 相似文献
9.
H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性 总被引：1，自引：0，他引：1
为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战. 相似文献
10.
为了开发用于南方水禽且适合血清学监测的H5亚型禽流感疫苗,作者通过反向遗传技术,删除A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1,S株)病毒HA编码多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,分别与A/duck/England/1/1956(H11N6,E株)和A/Chicken/Shanghi/F/98(H9N2,F株)的NA组合,再以本室禽源高产病毒F株的6个内部片段为骨架,构建全部基因都来自禽流感的疫苗株.成功拯救出2株重组病毒,分别命名为rH5N6/F和rH5N2/F,并引入分子标记N6和N2.重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,且rH5N6/F更适合在鸡胚中生产,对SPF鸡和鸡胚无致病性.重组病毒在clade2.3.4毒株中具有很好的抗原代表性,引入的分子标记有利于血清学监测的区分,为防控水禽H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株. 相似文献
11.
H9N2亚型禽流感病毒通常在鸡胚上增值性能高,但在细胞上增值能力差。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株,通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2,SH441)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)的6个内部基因进行人工重组,拯救并获得了1株禽流感重组病毒441-PR8,并对它的生物学特性进行了研究。结果表明,重组病毒441-PR8株在细胞上的增殖能力明显高于野生毒株SH441,该重组病毒有望成为H9N2亚型禽流感疫苗研制的候选毒株。 相似文献
12.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以104倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10~6EID_(50)剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10~6EID_(50)的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10~5EID_(50)的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10~5EID_(50)的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。 相似文献
13.
为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2) (SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株.生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性.采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性.rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒.H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础. 相似文献
14.
《中国预防兽医学报》2017,(8)
A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)是高滴度鸡胚适应流感病毒株,WHO 1969年将其推荐为流感病毒疫苗株内部基因供体株,本世纪以来其也被广泛用于H5N1流感疫苗株的内部基因供体株。本研究利用反向遗传技术以携带PB2基因K627E突变的PR8内部基因为骨架,以一株H7N9亚型低致病力禽流感病毒CK/HN的表面基因为供体,并在其HA基因引入V~(186)G和L~(226)Q双点突变,构建了一株重组病毒H7N9(HN)/PR8。固相ELISA受体结合特性分析结果显示,野生病毒CK/HN可同时结合α-2,6-糖链(人源受体成分)和α-2,3-糖链(禽源受体成分),并且与前者的亲和力高于后者;重组病毒H7N9(HN)/PR8对α-2,3-糖链的亲和力明显增高,对α-2,6-糖链的亲和力则显著下降。以10~6鸡胚半数感染量(EID_(50))接种SPF鸡后,CK/HN病毒可在鸡体内复制,通过呼吸道和泄殖腔向外排泄,感染鸡血清均转阳;H7N9(HN)/PR8接种的鸡泄殖腔和呼吸道均无病毒排出,也无血清转阳,表明H7N9(HN)/PR8病毒不能在鸡体内复制。本研究为H7N9疫苗株的构建奠定了重要基础。 相似文献
15.
《中国预防兽医学报》2016,(7)
致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。 相似文献
16.
为拯救具有高复制特性的G1-like型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)疫苗候选株，利用反向遗传操作技术，将高复制特性H9N2亚型CZ株(Y280-Like)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、M、NP、NS)与H9N2亚型40926株(G1-like)的HA和NA基因进行重配，构建G1-like型重组病毒。通过HA、HI试验及基因测序对拯救病毒进行鉴定，并对病毒在鸡胚上的复制能力、遗传稳定性及免疫原性进行评价。结果表明，利用6+2质粒系统成功拯救出G1-Like型H9N2亚型重组流感病毒，并具有良好的复制特性和遗传稳定性；将拯救的重组病毒株灭活后免疫SPF鸡，能刺激产生较高的HI抗体，为防控G1-like型AIV流行提供了技术和疫苗候选株储备。 相似文献
17.
《中国家禽》2017,(4)
近年来clade2.3.2.1c中的H5N1亚型禽流感病毒的抗原性发生了很大变化,Re-6疫苗并不能对其提供有效保护。为对该分支毒株进行有效防控,研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)毒株为内部基因供体,以clade2.3.2.1c的H5N1亚型毒株A/chicken/Jiangsu/YB7/2015(YB7)的HA和NA基因作外部供体,并删除YB7株HA中裂解位点处的多个碱性氨基酸,通过反向遗传方法成功拯救出1株重组病毒r YB7。r YB7株病毒在鸡胚和MDCK细胞上均有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。本实验室在对毒株抗原性研究的基础上研发的疫苗候选株为防控变异的clade2.3.2.1c的禽流感病毒提供了良好的疫苗备选。 相似文献
18.
免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。 相似文献
19.
为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。 相似文献
20.
《中国预防兽医学报》2020,(3)
2018年对宁夏回族自治区沙湖自然保护区进行禽流感病毒(AIV)流行病学调查中,本研究室分离到一株H13N8亚型AIV。为了解这株H13N8亚型AIV生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自H13N6和H3N8亚型AIV,内部基因来源于H13N8、H6N2、H13N6、H13N2亚型AIV,是一株多亚型重组AIV,其HA蛋白碱性裂解位点氨基酸序列为ISNR↓GLF,为低致病AIV分子标志。关键氨基酸位点分析显示,其M1蛋白具有N30D和T215A的突变,NS1蛋白具有P42S、L98F和I101M的突变,表明其具有增强对哺乳动物致病性的潜在能力。SPF鸡的感染性试验显示,鸡感染该病毒后不能通过喉头或泄殖腔排毒,在感染鸡各脏器均不能有效复制,其感染鸡的潜在风险较小。本研究对禽流感的综合防控具有一定的指导意义。 相似文献