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1.
为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、pMD18-T-WRgapC和pMD18-T-RFgapC经双酶切鉴定、测序及序列分析后,再将gapC基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,构建停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因原核表达质粒pET-28-TRgapC、pET-28-WRgapC和pET-28-RFgapC;将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳、纯化、复性后经Western blot检测,得到了约38 ku的条带,与预期大小相符。说明这3种蛋白有一定的免疫原性。 相似文献
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从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。 相似文献
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通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。 相似文献
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参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的App DNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3′端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD—ApxⅣ进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建了重组表达质粒pET—ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET—ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39．5KOa。利用HiTrap FF crude columns将表达的蛋白进行了纯化。 相似文献
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为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。 相似文献
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参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的AppDNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3’端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD-ApxⅣ进行BamHI、HindIII双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组表达质粒pET-ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET-ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39.5KDa。利用HiTrapFFcrude columns将表达的蛋白进行了纯化。 相似文献
9.
试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。 相似文献
10.
Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性.本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中.以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应.以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性.抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础. 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达 总被引：2，自引：2，他引：2
用PCR技术特异扩增了柔嫩史美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列，克隆至质粒pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及PCR确认正确后，将TA4基NcDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中，电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，获得重组质粒pMG36n-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。获得TA4乳酸乳球菌表达株，经SDS—PAGE电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。 相似文献
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狮头鹅PRL基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步研究PRL对狮头鹅繁殖性能的生理调节机制,采用RT-PCR方法从狮头鹅脑垂体组织扩增获得PRL基因的cDNA序列,克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-PRL,并进行序列测定和分析。将测序正确的cDNA序列定向克隆到pET32a(+),构建表达载体pET32a-PRL,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western Blot分析。狮头鹅PRL基因编码区含有600个核苷酸,编码199个氨基酸(GenBank No.GQ856665),与其它禽类PRL具有高度保守性;狮头鹅PRL蛋白二级结构由多个α螺旋和β转角及无规卷曲构成,推测N端70～76、95～102、150～155和207～213区段为其抗原表位的优势区。SDS-PAGE检测表明狮头鹅PRL基因在大肠杆菌中获得了高效表达,可溶性表达产物约占全菌总蛋白的53.6%,融合蛋白分子量约41ku,并用镍柱亲和层析法分离纯化融合蛋白。Western Blot分析证实了所获的融合蛋白具有较强抗原性。试验结果为进一步研究PRL基因的生物功能及其对狮头鹅就巢、产蛋等生产性状的影响奠定了基础。 相似文献
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本研究根据已发表的小核糖核酸病毒（picornavirus）核苷酸序列设计4对引物。以RNAiso Reagent试剂抽提含DHV A66鸡胚尿囊液总RNA ，用TakaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0试剂盒进行RT-PCR扩增，将所得PCR产物回收并克隆于pMD18-T 载体、转化感受态细菌DH5а，利用氨苄青霉素筛选阳性克隆子, 经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。取重组阳性质粒进行测序，测序结果与近期GenBank登录的3株Ⅰ型DHV核苷酸序列比对，结果显示与03D株、H株、5886株鸭肝炎病毒的核酸序列同源性分别为96.8%、96.3%、96.2%，表明成功构建了DHV A66 株部分cDNA文库。 相似文献
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鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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牦牛病毒性腹泻病毒E 1基因的克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物,利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E 1基因,并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector,经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析,克隆得到的E 1基因与Osloss株同源性最高,但核苷酸同源性仅为73.3%,推导氨基酸同源性仅为82.6%,表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果,或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。 相似文献
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试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。 相似文献
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单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。 相似文献