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1.
本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2016,(7):1178-1182
用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。 相似文献
3.
Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。 相似文献
4.
为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM001009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。 相似文献
5.
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
6.
本研究对乳房链球菌GapC蛋白基因进行了克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性试验。应用PCR技术直接从临床分离的乳房链球菌菌株基因组中扩增出GapC蛋白基因,并将其克隆至pET28a（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）中表达。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的乳房链球菌GapC基因序列AF421900的同源性为99．8％。氨基酸同源性为100％;与GenBank发表的无乳链球菌GapC基因序列AF421899的同源性为91．4％;与停乳链球菌GapC基因序列AF375662的同源性为88．9％。表达的融合蛋白通过MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒纯化,纯化蛋白免疫小鼠3次,制备GapC抗血清。本研究表达和纯化了乳房链球菌GapC蛋白,并制备出鼠抗血清,为下一步开展GapC重组蛋白的应用研究莫定了基础。 相似文献
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为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a（＋）-GAPC。用BL21（DE3）/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果表明,PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中乳房链球菌（AF421900.1）GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21（DE3）/pET-32a（＋）-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Western blot分析显示,GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC,为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。 相似文献
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猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。 相似文献
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透明质酸酶(HylB)是无乳链球菌重要的毒力因子。根据本实验室分离并公布在GenBank上的罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001全基因组序列,PCR扩增获得长为2 346 bp,覆盖hylB保守功能区的基因片段。将该片段采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化后亚克隆至表达载体pET28a(+),经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行体外原核表达,获得88.5 ku的目的蛋白。将纯化后的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经ELISA和Western blot鉴定该蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
11.
为获得狂犬病病毒（RV）糖蛋白抗原，采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因，将其克隆于pMD18-T载体，再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因，将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）、pET-32a（＋）和pGEX-4T-1中，经PCR和双酶切鉴定以及序列分析，表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）中进行表达，结果显示，克隆到pET-32a（＋）的糖蛋白膜外区基因表达量最高，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测，不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应，表明，重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析.结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B.再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1.经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21（DE3）（pLysS）感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白.用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性. 相似文献
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试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。 相似文献
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采用 PCR 方法从马腺疫链球菌新疆分离株中扩增 FNE 基因片段,克隆至 pMD19-T 载体。利用分子生物学软件分析测序结果,将 FNE 截短基因亚克隆至原核表达载体 pET-30a 中,转化到大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3）感受态细胞,以 IPTG 诱导 FNE 重组蛋白的表达,用 SDS-PAGE 和 Western blot 法分析蛋白表达及其反应原性。序列分析显示,其与 GenBank 收录的马腺疫链球菌4047（登录号YP002747216）核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99％。采用 PCR 法扩增到675 bp 的 FNE 截短基因片段构建重组表达载体获得重组蛋白,经 SDS-PAGE 分析在46 ku 处出现明显条带,Western blot 分析显示具有反应原性。成功克隆和表达了马腺疫链球菌的 FNE 截短基因,为重组 FNE 蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
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根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性. 相似文献
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山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
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为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
20.
本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。 相似文献